Produção e caracterização de células multipotentes e pluripotentes induzidas em Blastocerus dichotomus

Abstract

Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida (“induced pluripotent stem cells” - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, condrócitos e osteócitos) para avaliar sua plasticidade in vitro. Ainda, foi caracterizada a expressão de marcadores moleculares por meio da imunocitoquímica (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) e RT-qPCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). A segunda meta teve como enfoque a derivação de células iPSC a partir das linhagens tronco multipotentes obtidas anteriormente. A derivação das linhagens iPSC foi testada pelo uso de integração gênica que exprimem quatro fatores de transcrição (c-Myc, Klf4, Oct4 e Sox2) pelos métodos de nucleofecção, lipofecção ou lentiviral. As colônias do tipo iPSC foram obtidas somente pelo método de nucleofecção e foram repicadas isoladamente. Porém, falharam em estabelecer linhagens clonais para posterior caracterização. A terceira meta deste trabalho visou estabelecer linhagens de células semelhantes as germinativas primordiais (“Primordial germ cell-like” PGCLs). Devido a falha em reprogramar as células-tronco adultas em iPSC, foram estabelecidas as linhagens de PGCLs por diferenciação de células de chifre, gordura e pele, passando pela fase de células semelhantes as epiblásticas (“epiblast-like cells” EpiLCs) e posteriormente sendo diferenciadas nas PGCLs. Após diferenciação, as PGCLs foram submetidas a testes de imunocitoquímica (DDX4 e DAZL) e RT-qPCR (DDX4, Stra8, Stella, Fragilis, OCT4). Ainda, foi testada a influência do ácido retinoico e do BMP4, bem como os sistemas de cultivo em adesão e em suspensão para a diferenciação das células multipotentes em PGCLs.