Caracterização de peptídeos antimicrobianos e avaliação do potencial para o controle do cancro cítrico e do Huanglongbing
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Data
2024-01-08
Orientador
Wulff, Nelson Arno 
Coorientador
Pós-graduação
Biotecnologia - IQAR 33004030077P0
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
O Brasil é o maior produtor de laranja-doce do mundo. Apesar da contribuição do setor para a economia nacional, fatores bióticos acometem o cinturão citrícola brasileiro, impactando diretamente na viabilidade do setor. Entre as doenças bacterianas que afetam as laranjeiras-doces destacam-se o cancro cítrico causado pela Xanthomonas citri subsp. citri e o Huanglongbing (HLB) associado à Candidatus Liberibacter asiaticus (Las). Hoje a principal alternativa ao controle químico do cancro cítrico trata-se da aplicação de produtos à base de cobre como medida protetiva, o qual traz risco de seleção de estirpes resistentes ao cobre, além de ser um metal pesado que pode acumular no solo. O manejo do HLB envolve a aplicação de inseticidas para controlar o psilídeo Diaphorina citri, inseto vetor das bactérias, e a erradicação de plantas sintomáticas. Entretanto, não há forma de controle direto da bactéria e a incidência do HLB vem aumentando ao longo dos anos, no Brasil. O objetivo do projeto foi testar peptídeos com potencial atividade antibiótica frente as bactérias Xanthomonas citri (Xcc) e Liberibacter crescens (Lcr), uma espécie cultivável em meio de cultura e filogeneticamente próxima à Las, no cultivo in vitro. Neste trabalho, sete peptídeos foram obtidos por síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS), purificados por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) e identificados por espectrometria de massa ion-trap. Em ensaios in vitro, os peptídeos Gr01, Guavanin-2, K13 e Lin3 tiveram ação antibiótica sobre Xcc e Lcr em concentrações abaixo de 12,5 µmol.L-1. Ensaios hemolíticos mostraram que Gr01 apresentou atividade hemolítica somente em concentrações peptídicas superiores a 50 µmol.L-1 contra eritrócitos humanos. Estudos com miméticos de membrana demonstraram que Gr01, Guavanin-2 e K13 atuam promovendo a lise da membrana bacteriana, enquanto Lin3 possui mecanismo de ação distinto. Para Xcc, Gr01 e K13 apresentaram atividade protetiva em experimentos in planta, sendo capazes de controlar até 87 e 75%, respectivamente, do desenvolvimento da bactéria. Para Las, plantas aspergidas com BP178, K13 e HLB01 apresentaram 10, 10 e 10% de incidência de plantas positivas para HLB após 332 dias da exposição aos insetos infectivos com Las, enquanto o controle apresentou incidência de 60% de plantas positivas para a doença. A indução da expressão de genes relacionados a ativação do sistema de defesa vegetal por meio das vias do AJ e AS foi avaliada: em plantas sadias, Gr01, Guavanin-2, HLB01, HLB02 e Lin3 foram os peptídeos que mais induziram a expressão de NPR1, BSMT1, PR2 e , LOX com distinção nos tempos avaliados. Para plantas infectadas com Las, BP178, HLB01, HLB02 e K13 induziram maiores valores de expressão dos genes NPR1, PR2 e LOX. Os resultados obtidos evidenciam o potencial uso e aplicação biotecnológica de moléculas peptídicas para o desenvolvimento de novas terapias contra fitopatógenos e atividade eliciadora do sistema de defesa vegetal em citros.
Resumo (inglês)
Brazil is the largest producer of sweet oranges in the world. Despite the contribution to the national economy, biotic factors have been affecting the Brazilian citrus belt, directly impacting the sector's viability. Among the bacterial diseases that affect sweet orange trees, citrus cancer caused by Xanthomonas citri subsp. citri and Huanglongbing (HLB) associated with Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) stands out. Today, the main alternative to chemical control of citrus canker is the application of insoluble copper-based products as a protective measure, which poses a risk of selecting copper-resistant strains, in addition to being a heavy metal that can accumulate in the soil. HLB management involves the application of insecticides to control the psyllid Diaphorina citri, the disease vector, and eradication of diseased plants. However, there is no way to directly control the bacteria and the incidence of HLB has increased over the years. The main purpose of the project was to evaluate peptides with potential antibiotic activity against Xanthomonas citri (Xcc) and Liberibacter crescens (Lcr), a cultivable strain and phylogenetically close to Las, in in vitro assays. In this work, seven peptides were synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPFS), purified by reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC-RP) and identified by ion-trap mass spectrometry. In in vitro antibiotic assays, Gr01, Guavanin-2, K13 and Lin3 acted on Xcc and Lcr at concentrations below 12.5 µmol.L-1. Hemolytical assays showed that Gr01 presented hemolytic activity only at peptide concentrations greater than 50 µmol.L-1 against human erythrocytes. Studies with membrane mimetics demonstrated that Gr01, Guavanin-2 and K13 act by promoting bacterial membrane lysis, while Lin3 has a distinct mechanism of action. For Xcc, Gr01 and K13 showed protective activity, being able to control up to 87 and 75%, respectively, of the bacteria's development in planta. For Las, plants sprayed with BP178, K13 and HLB01 showed 10, 10 and 10% incidence of HLB-positive plants after 332 days of exposure to Las-infected insects, while the negative control showed a 60% incidence of HLB-positive plants. The induction of gene expression related to the activation of the plant defense system through AJ and AS pathways was evaluated: for healthy plants, Gr01, Guavanin-2, HLB01, HLB02 and Lin3 were the peptides that most induced the expression of NPR1, BSMT1, PR2 and LOX at the different times evaluated. For plants infected with Las, BP178, HLB01, HLB02 and K13 induced higher expression values of the NPR1, PR2 and LOX genes at the evaluated times. The results obtained are promising and highlight the potential use and biotechnological application of peptide molecules for the development of new antibiotics against phytopathogens and eliciting activity of the plant defense system.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
SANCHES, Beatriz Cristina Pecoraro. Caracterização de peptídeos antimicrobianos e avaliação do potencial para o controle do Cancro cítrico e do Huanglongbing. 2024. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2024.