Estudo funcional e rastreamento de novos inibidores da enzima desoxi-hipusina sintase de organismos eucariotos patogênicos
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Data
2023-03-30
Autores
Orientador
Zanelli, Cleslei Fernando 
Coorientador
Pós-graduação
Biotecnologia - IQ
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A enzima desoxi-hipusina sintase (DHS) catalisa a primeira etapa da modificação póstraducional do fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A), que é a única proteína conhecida a conter o aminoácido hipusina, proveniente dessa modificação. Ambos eIF5A e DHS são essenciais para a viabilidade celular em eucariotos e a inibição de DHS poderia ser uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas contra doenças tropicais negligenciadas (DTNs). Nesse trabalho, nós buscamos por inibidores das enzimas DHS de Leishmania major e Plasmodium vivax, organismos causadores de leishmaniose cutânea e malária, respectivamente. Primeiramente foi realizada a triagem virtual da biblioteca de compostos do banco de dados ChEMBL- NTD. Foram selecionados 9 candidatos, que foram testados em um ensaio automatizado usando linhagens de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas, contendo o gene DHS endógeno substituído pelos genes DHS de H. sapiens (HsDHS), L. major (LmDHS) ou P. vivax (PvDHS). Dos 9 compostos, três apresentaram resultados promissores in vivo a uma concentração de 100 µM, sendo que o composto GNF-Pf-744 reduziu 65% do crescimento da linhagem dys1Δ::PvDHS, ChEMBL1081521 inibiu 37% dys1Δ::LmDHS e GNF-Pf-3738 inibiu 27% de crescimento de dys1Δ::PvDHS e 33% de dys1Δ::LmDHS, nessa concentração. A citotoxicidade geral desses compostos foi analisada nas linhagens de mamífero MCF7 e HepG2 e apenas o composto GNF-Pf- 3738 foi tóxico em concentrações de até 100 µM. Além disso, foi realizado um rastreamento de 400 compostos da coleção The Pathogen box em S. cerevisiae, do qual o composto, MMV676584 reduziu o crescimento da levedura dys1Δ complementada por PvDHS. Um ensaio bioquímico in vitro, baseado em fluorescência, foi padronizado para a confirmação da enzima DHS como alvo, no entanto a maioria dos compostos foram fluorescentes no comprimento de onda testado e não puderam ser testados por esse ensaio. Assim, um ensaio de detecção da hipusinação por western blot foi padronizado para confirmação dos hits, no qual os compostos GNF-Pf-744 e MMV676584 a 100 µM reduziram significativamente em 60 e 70% a taxa de eIF5A hipusinado por PvDHS. Os novos ligantes de DHS encontrados nesse trabalho, GNF-Pf-744 e MMV676584, podem ser pontos de partida para o desenvolvimento de novos inibidores para a proteína DHS dos parasitas estudados.
Resumo (inglês)
The enzyme deoxyhypusine synthase (DHS) catalyzes the first step in the post- translational modification of eukaryotic translation factor 5A (eIF5A), which is the only known protein to contain the amino acid hypusine prevenient from this modification. Both eIF5A and DHS are essential for cell viability in eukaryotes and DHS inhibition could be a promising strategy for the development of new therapeutic alternatives against neglected tropical diseases (NTDs). In this work, we searched for DHS enzyme inhibitors from Leishmania major and Plasmodium vivax, organisms that cause cutaneous leishmaniasis and malaria, respectively. First, the virtual screening of the compounds library from the ChEMBL-NTD database was performed. Nine candidates were selected and tested in a robotized assay using genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains containing the endogenous DHS gene replaced by the DHS genes from H. sapiens (HsDHS), L. major (LmDHS) or P. vivax (PvDHS). Of the nine compounds, three showed promising results in vivo, reducing the cell growth from the complemented strains at a concentration of 100 μM, with the compound GNF- Pf-744 reducing 65% of the growth of the dys1Δ::PvDHS strain, ChEMBL1081521 inhibiting 37% dys1Δ::LmDHS and GNF-Pf-3738 inhibited 27% growth of dys1Δ::PvDHS and 33% of dys1Δ::LmDHS at this concentration. The general cytotoxicity of these compounds was analyzed in the mammalian strains MCF7 and HepG2 and only the compound GNF-Pf-3738 was toxic at concentrations up to 100 μM. In addition, a screening of 400 compounds from The Pathogen box collection in S. cerevisiae was performed, of which the compound, MMV676584 reduced the growth of dys1Δ yeast complemented by PvDHS. An in vitro biochemical assay, based on fluorescence, was standardized in order to confirm the DHS enzyme as a target, however, most of the compounds were fluorescent at the tested wavelength and could not be analyzed by this assay. Thus, a western blot detection assay was standardized to confirm the hits, in which the compounds GNF-Pf-744 and MMV676584 at 100 μM significantly reduced by 60 and 70%, respectively, the rate of eIF5A hypusinated by PvDHS. The new DHS ligands found in this work, GNF-Pf-744 and MMV676584, can be starting points for the development of new inhibitors for the DHS protein of the studied parasites.
Descrição
Idioma
Português