Síntese, purificação e caracterização de peptídeo derivado da proteína enolase de Sporothrix spp.

Abstract

Vacinas peptídicas são uma nova classe de vacinas que utilizam pequenos fragmentos de proteínas para estimular a resposta imune contra doenças, incluindo infecções e câncer. Elas são promissoras por serem mais seguras e específicas do que as vacinas convencionais. No campo das doenças fúngicas, as vacinas peptídicas ainda são pouco exploradas, mas estudos estão sendo conduzidos para desenvolver vacinas eficazes, como para a esporotricose, uma zoonose endêmica no Brasil transmitida principalmente por gatos infectados por Sporothrix brasiliensis. A vacinação profilática de gatos é vista como uma alternativa para reduzir a transmissão da doença. Pesquisas anteriores mostraram que peptídeos derivados da proteína enolase de Sporothrix spp., combinados com o adjuvante de Freund, induziram respostas imunológicas protetoras em camundongos. No entanto, é necessário um adjuvante eficaz e não tóxico para uso in vivo. O peptídeo RS09, um agonista sintético do receptor TLR-4, tem demonstrado potencial como adjuvante molecular ao induzir respostas imunológicas Th1 e Th17. O objetivo deste trabalho foi a síntese, purificação e caracterização de uma sequência peptídica derivada da proteína enolase de Sporothrix spp. (sequência 2765), combinada com o adjuvante RS09, na tentativa de desenvolver um peptídeo potencialmente imunogênico e menos tóxico comparado ao uso do adjuvante de Freund. Os resultados obtidos mostraram que o peptídeo P4 apresentou sucesso na síntese em fase sólida pela estratégia Fmoc, considerando os sinais e as razões m/Z teóricos e experimentais, bem como a massa molecular experimental e a massa molecular teórica. Também demonstrou-se que o peptídeo apresentou-se antigênico nos ensaios ELISA indireto, reagindo com soro de animais previamente imunizados com a proteína enolase recombinante de Sporothrix spp. e soros de animais previamente desafiados com as cepas Ss250 e Ss256 de Sporothrix brasiliensis, espécie mais patogênica do gênero. Essa antigenicidade apresentada demonstra a presença de epitopos B em P4 e seu potencial de induzir a produção de anticorpos, além disso, a antigenicidade da sequência 2765 da proteína enolase, verificada em estudos prévios, não foi prejudicada ao adicionar a sequência RS09. Os resultados sugerem a possibilidade de considerar a sequência RS09 como adjuvante em formulações vacinais contra a esporotricose.

Peptide vaccines are a new class of vaccines that use small protein fragments to stimulate na immune response against diseases, including infections and cancer. They are promising due to being safer and more specific than conventional vaccines. In the field of fungal diseases, peptide vaccines are still underexplored, but studies are being conducted to develop effective vaccines, such as for sporotrichosis, an endemic zoonosis in Brazil, primarily transmitted by cats infected with Sporothrix brasiliensis. Prophylactic vaccination of cats is seen as na alternative to reduce disease transmission. Previous research has shown that peptides derived from the enolase protein of Sporothrix spp., combined with Freund’s adjuvant, induced protective immune responses in mice. However, an effective and non-toxic adjuvant for in vivo use is needed. The RS09 peptide, a synthetic agonist of the TLR-4 receptor, has shown potential as a molecular adjuvant by inducing Th1 and Th17 immune responses. The objective of this study was the synthesis, purification, and characterization of a peptide sequence derived from the enolase protein of Sporothrix spp. (sequence 2765), combined with the RS09 adjuvant, in an attempt to develop a potentially immunogenic and less toxic peptide compared to the use of Freund’s adjuvant. The results obtained showed that the P4 peptide was successfully synthesized by the Fmoc solid-phase strategy, considering the theoretical and experimental m/Z signals and ratios, as well as the experimental and theoretical molecular mass. It was also demonstrated that the peptide was antigenic in indirect ELISA assays, reacting with serum from animals previously immunized with recombinant enolase protein from Sporothrix spp. and serum from animals previously challenged with Ss250 and Ss256 strains of Sporothrix brasiliensis, the most pathogenic species of the genus. This antigenicity demonstrated the presence of B-cell epitopes in P4 and its potential to induce antibody production. Moreover, the antigenicity of the 2765 enolase protein sequence, as verified in previous studies, was not compromised by the addition of the RS09 sequence. The results suggest the potential of considering the RS09 sequence as an adjuvant in vaccine formulations against sporotrichosis.