LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DE PROTEÍNAS DE Xanthomonas citri subsp. citri UTILIZANDO PROTEÍNA REPÓRTER

Abstract

Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é uma bactéria fitopatogênica, conhecida por causar Cancro Cítrico Asiático (CCA) na maioria das espécies economicamente importantes de citros. A bactéria possui em seu genoma inúmeros genes que codificam para proteínas sem função descrita. A elucidação da localização subcelular e da função dessas proteínas são uma importante estratégia para o entendimento dos mecanismos e vias envolvidos na interação planta-patógeno. Assim, um vetor integrativo (pMAJIIc) contendo a proteína vermelha fluorescente mCherry foi construído com o objetivo de possibilitar a expressão e localização intracelular de proteínas de X. citri fusionadas a mCherry. O vetor pMAJIIc se integra no gene da α-amilase de X. citri, mas a interrupção do gene α-amilase não afetou a patogenicidade e a virulência da bactéria e a integração do vetor ao cromossomo bacteriano se manteve estável ao longo de diversas gerações. Com este vetor foi possível demonstrar em X. citri um padrão de emissão de fluorescência para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas. A proteína VrpA fusionada a mCherry foi visualizada circundando a membrana externa bacteriana, enquanto a proteína GyrB fusionada a mCherry foi visualizada difusa pelo citoplasma, com alguns pontos de acumulação localizados próximos aos polos da célula. O vetor também foi utilizado para a caracterização e localização subcelular da proteína hipotética XAC0024 de X. citri, agora anotada como EnvC. O mutante para o gene envC (ΔenvC) apresentou virulência reduzida e atraso no desenvolvimento das lesões típicas de cancro cítrico quando inoculado em folhas de limão cravo (Citrus limonia Osbeck). Além disso, o mutante ΔenvC apresentou células morfologicamente alteradas, com formato filamentoso e formação de minicélulas, indicando que essa proteína é um dos fatores responsáveis pela correta separação de células filhas bacterianas. A localização subcelular da proteína EnvC fusionada a mCherry apresentou o padrão descrito para proteínas periplasmáticas, sendo visualizada circundando a membrana externa bacteriana. Assim, pela primeira vez demonstramos que fusões com mCherry para localização subcelular de proteínas em X. citri utilizando vetor integrativo permite a identificação de um padrão de emissão de fluorescência específico para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas, o que tornou possível a caracterização de uma proteína até então sem função conhecida em X. citri

Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is a phytopathogenic bacterium well known for causing Asiatic Citrus Canker (CCA) in the most economically important citrus species. The bacterium has in its genome sevral genes that code for proteins with no described function. The elucidation of the subcellular localization and function of these proteins is an important strategy for understanding the mechanisms and pathways involved in plant-pathogen interaction. Thus, an integrative vector (pMAJIIc) containing the red fluorescent protein mCherry was constructed to enable the expression and intracellular localization of mCherry fused proteins in X. citri. The pMAJIIc vector integrates into X. citri’s α-amylase gene, but disruption of the α-amylase gene did not affect the pathogenicity and virulence of the bacterium, and the integration of the vector into the bacterial chromosome remained stable over several generations. Using this vector, it was possible to demonstrate a fluorescence emission pattern for cytoplasmic and periplasmic proteins in X. citri. The mCherry fused VrpA protein was visualized surrounding the bacterial outer membrane, while the mCherry fused GyrB protein was visualized diffused by the cytoplasm, with some accumulation points located near the cell poles. The vector was also used for the characterization and subcellular localization of X. citri’s hypothetical protein XAC0024, now named EnvC. The mutant for envC gene (ΔenvC) showed reduced virulence and delayed development of the typical lesions of citrus canker when inoculated in leaves of Rangpur lime (Citrus limonia Osbeck). In addition, the ΔenvC mutant showed morphologically altered cells with filamentous shape and formation of minicells, indicating that this protein is one of the factors responsible for the correct separation of bacterial daughter cells. The subcellular localization of the mCherry-fused EnvC protein showed the pattern described for periplasmic proteins, being visualized surrounding the bacterial outer membrane. Thus, for the first time we demonstrated that the mCherry fusions for subcellular localization of protein in X. citri using the integrative vector allows the identification of a specific fluorescence emission pattern for cytoplasmic and periplasmic proteins, which allowed the characterization of a protein with no known function in X. citri.