Produção de carotenoides a partir da fermentação de Rhodotorula spp.

Abstract

Os carotenoides constituem uma classe de pigmentos lipossolúveis que desempenham um papel crucial na coloração manifestada em microrganismos, frutas e hortaliças. Esta classe abarca uma diversidade de tonalidades. Em virtude de suas propriedades antioxidantes e anticancerígenas, os carotenoides são frequentemente empregados na indústria farmacêutica e cosmética, além de serem utilizados na formulação de corantes alimentícios e suplementos dietéticos. O gênero Rhodotorula é conhecido pelo seu potencial de produzir quantidades consideráveis de carotenoides. O objetivo do presente estudo foi analisar a produção de carotenoides por Rhodotorula spp. em escala laboratorial e realizar testes de aumento de escala em biorreator de bancada em processo batelada. Inicialmente, a levedura foi cultivada em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL, variando meios de cultivo (YPD e YM), além de pH (3, 5, 7 e 9). Posteriormente, com as melhores condições de cultivo definidas (meio YM e pH 5), iniciou-se a produção de carotenoides em um biorreator de tanque agitado de 2L com volume útil de 1,5L, a 30 o C, sob agitação de 300 rpm e aeração 1 vvm, na ausência de luz, por 72 horas. Após a fermentação, a densidade celular foi determinada por espectrofotometria a 600 nm, a quantificação de açúcar redutor pelo método colorimétrico de DNS e a extração de carotenoides da biomassa foi realizada utilizando solvente de etanol e lactato de etila (2:1, v/v) e acetona, assim como a identificação de carotenoides por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (coluna C 18 mantida a 30 o C, fase móvel constituída de metanol, acetonitrila e diclorometano, 60:10:30, v/v/v) e varredura entre os comprimentos de ondas de 300 a 600 nm por espectroscopia UV-Vis. Para o tratamento adequado dos resíduos produzidos, foram conduzidas análises de sólidos, determinação da demanda química de oxigênio (DQO), determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl e extração e quantificação de lipídios por cromatografia gasosa. Foi verificada a viabilidade da produção de carotenoides por Rhodotorula spp. em escala laboratorial e seu aumento de escala em um biorreator de 2 L. Embora não fosse possível quantificar os carotenoides produzidos por CLAE devido ao custo dos padrões, a análise cromatográfica e espectrofotometria confirmou a produção de toruleno (480 nm) e torularodina (500 nm). O escalonamento da produção e o tratamento combinado com a maceração de biomassa pré-tratada por congelamento/descongelamento com o uso de pérolas de vidro contribuíram para o aumento da eficiência de extração de toruleno (de 0,19 UA para 0,55 UA) e torularodina (de 0,17 UA para 0,43 UA), representando um aumento de aproximadamente 66% e 60%, respectivamente. Ademais, foi observado que o meio YM foi mais eficiente no aproveitamento de açúcar em comparação ao YPD, no entanto, sem diferença significativa quanto ao crescimento celular. Em relação ao pH, este não influenciou significativamente a produção de carotenoides. Mas a formação de carotenoides durante o cultivo de Rhodotorula spp. afetou o pH do meio de cultura. A degradação dos carotenoides extraídos com a mistura de lactato de etila e etanol impediu a determinação do solvente mais eficaz, porém tanto a acetona quanto a mistura de lactato de etila e etanol foram capazes de extrair os compostos. A análise de resíduos indicou uma alta carga orgânica (10,96 ± 0,24 g/L), necessitando de estudos para tratamento adequado. Por fim, não foram obtidos resultados mensuráveis para a quantidade de nitrogênio nos resíduos analisados pelo método de Kjeldahl. Além disso, também não foram identificados lipídios por cromatografia gasosa. A biomassa, portanto, contendo resquícios de nutrientes e carotenoides, poderia ser reaproveitada como aditivo em fertilizantes, ionutrientes na alimentação animal e suplementos nutricionais.

Carotenoids constitute a class of liposoluble pigments that play a crucial role in the coloration manifested in microorganisms, fruits, and vegetables. This class encompasses a diversity of hues. Due to their antioxidant and anticancer properties, carotenoids are frequently employed in the pharmaceutical and cosmetic industries, as well as in the formulation of food colorants and dietary supplements. The genus Rhodotorula is known for its potential to produce considerable amounts of carotenoids. The aim of the present study was to analyze the production of carotenoids by Rhodotorula spp. on a laboratory scale and to conduct scale-up tests in a bench-scale bioreactor in a batch process. Initially, the yeast was cultivated in 250 mL Erlenmeyer flasks, varying the culture media (YPD and YM), as well as the pH (3, 5, 7, and 9). Subsequently, with the best cultivation conditions defined (YM medium and pH 5), carotenoid production was initiated in a 2L stirred tank bioreactor with a working volume of 1.5L, at 30°C, under agitation of 300 rpm and aeration at 1 vvm, in the absence of light, for 72 hours. After fermentation, cell density was determined by spectrophotometry at 600 nm, reducing sugar quantification by the DNS colorimetric method, and carotenoid extraction from the biomass was performed using ethanol and ethyl lactate (2:1, v/v) and acetone as solvents. Carotenoids were identified by high-performance liquid chromatography (HPLC) (C18 column maintained at 30°C, mobile phase consisting of methanol, acetonitrile, and dichloromethane, 60:10:30, v/v/v) and scanning between wavelengths of 300 to 600 nm by UV-Vis spectroscopy. In order to ensure the optimal treatment of the produced residues, a series of analyses were conducted, including the determination of the solids content, the chemical oxygen demand (COD), the nitrogen content by the Kjeldahl method, and the extraction and quantification of lipids by gas chromatography were conducted. The feasibility of carotenoid production by Rhodotorula spp. on a laboratory scale and its scale-up in a 2L bioreactor was verified. Although it was not possible to quantify the carotenoids produced by HPLC due to the cost of standards, chromatographic analysis and spectrophotometry confirmed the production of torulene (480 nm) and torularhodin (500 nm). The scaling up of production and the combined treatment with maceration of biomass pre-treated by freezing/thawing with the use of glass beads contributed to the increased extraction efficiency of torulene (from 0.19 AU to 0.55 AU) and torularhodin (from 0.17 AU to 0.43 AU), representing an increase of approximately 66% and 60%, respectively. Additionally, it was observed that the YM medium was more efficient in sugar utilization compared to YPD, although no significant difference in cell growth was identified. With regard to pH, it was found that this did not significantly influence carotenoid production. However, it was observed that carotenoid formation during the cultivation of Rhodotorula spp. affected the culture medium's pH. The degradation of carotenoids extracted with the ethyl lactate and ethanol mixture prevented the determination of the most effective solvent. However, both acetone and the ethyl lactate and ethanol mixture were able to extract the compounds. The residue analysis indicated a high organic load (10.96 ± 0.24 g/L), necessitating further studies to determine the most appropriate treatment. Finally, the nitrogen content in the residues analyzed by the Kjeldahl method could not be measured. Furthermore, no lipids were identified by gas chromatography. Consequently, the biomass, which contains residual nutrients and carotenoids, could be reused as an additive in fertilizers, bionutrients in animal feed, and nutritional supplements.