Relação bidirecional entre a periodontite apical e a fibrose hepática: estudo de inflamassoma, citocinas e anticorpo CD20

Abstract

A inter-relação entre as alterações sistêmicas com o desenvolvimento e progressão de infecções orais como a periodontite apical tem sido objeto de intensos estudos nos últimos anos. O objetivo deste trabalho foi analisar a resposta imunoinflamatória nos tecidos periapicais e hepáticos, em condições de periodontite apical (PA) combinada ou não da presença de fibrose hepática (FH) por meio do silenciamento do inflamassoma NLRP3. Quarenta C57BL/6J wild type (wt) foram divididos em 4 grupos (n=10): Grupo Controle - Cwt; Grupo PAwt - portadores de PA; Grupo FHwt - portadores de FH; Grupo PA+FHwt - portadores de FH e PA. Outros quarenta camundongos Nlrp3tm1Hhf/J knockout (ko) foram divididos em 4 grupos (n=10): Grupo Controle - Cko; Grupo PAko - portadores de PA; Grupo FHko - portadores de FH; Grupo PA+FHko - portadores de FH e PA. A FH foi induzida pela administração do tetracloreto de carbono (CCl4) na dosagem de 0,2 ml/100g de peso corporal, duas vezes por semana, via intraperitoneal, e durante todo o experimento (60 dias). Após 30 dias do início da administração da droga, a PA foi induzida por meio de exposição pulpar dos primeiros e segundos molares superiores e inferiores esquerdo. Após mais 30 dias, os camundongos foram eutanasiados e as maxilas, assim como os fígados, foram coletados para análise em microscopia de luz. O tecido hepático foi analisado em coloração de Hematoxilina-Eosina (H&E) e Picrosírius Red (PSR) para verificação do grau de fibrose hepática. As maxilas foram processadas para análise histológica em H&E. Os dois órgãos foram submetidos a análise imunoistoquímica para NLRP3, IL-1β, IL-18, IL-17 e CD20. Os resultados obtidos foram analisados e comparados por testes estatísticos específicos para cada caso com nível de significância de 5% (P <0.05). Nas maxilas, a inflamação periapical foi mais severa nos animais wt com diferenças entre os grupos PAwt e PAko, PA+FHwt e PA+FHko, e entre PAwt e PA+FHwt (P <0.05). Não houve diferença entre os grupos PAko e PA+FHko (P >0.05). Quanto à reabsorção óssea periapical, os animais wt apresentam lesões periapicais maiores quando comprado aos camundongos ko (P <0.05), com diferenças entre os grupos PAwt e PAko, PA+FHwt e PA+FHko, PAwt e PA+FHwt, e entre PAko e PA+FHko (p<0,05). A imunomarcação para o NLRP3 nos animais ko foi ausente em todos os grupos. A análise revelou maior imunomarcação da IL-1β, IL-17, IL-18 e CD20 nos animais wt com diferenças entre os grupos PAwt e PAko (P <0.05). Houve diferença entre os grupos PAwt e PA+FHwt para NLRP3, IL-1β, IL-17 e CD20 (P <0.05). Não houve diferença na imunomarcação entre os grupos PAko e PA+FHko (P >0.05). Nos fígados, a inflamação hepática foi mais severa nos animais wt comparado aos ko e entre FHwt e PA+FHwt (P <0.05). Não houve diferença entre os grupos FHko e PA+FHko (P >0.05). O estágio da fibrose hepática foi mais acentuado nos animais wt comparado com os ko (P <0.05). Não houve diferença entre os grupos FHwt e PA+FHwt, FHko e PA+FHko (P >0.05). A imunomarcação foi maior para a IL-1β, IL-17, Il-18 e CD20 nos animais wt comparado aos ko (P <0.05). Houve diferença entre os grupos FHwt e PA+FHwt (P <0.05) para NLRP3 e IL-17. Não houve diferença na imunomarcação entre os grupos FHko e PA+FHko (P >0.05). Conclui-se que o silenciamento do inflamassoma NLRP3 exerce papel importante na modulação da PA e da FH, reduzindo o processo inflamatório e os mediadores inflamatórios envolvidos em ambas as alterações isoladas ou associadas. Além disso, ficou evidente que NLRP3 e IL-17 estão envolvidos no mecanismo bidirecional das duas doenças.

The interrelationship between systemic changes and the development and progression of oral infections such as apical periodontitis has been the subject of intense studies in recent years. The main of this study was to analyze the immunoinflammatory response in periapical and hepatic tissues, in conditions of apical periodontitis (AP) combined or not with the presence of hepatic fibrosis (LF) by silencing the NLRP3 inflammasome. Forty C57BL/6J wild type (wt) mice were divided into 4 groups (n=10): Cwt group: health mice; APwt group: mice with pulp exposure-induced apical periodontitis; LFwt group: mice with liver fibrosis induced; AP+LFwt group: mice with LF and AP. Another forty Nlrp3tm1Hhf/J knockout (ko) mice were divided into 4 groups (n=10): Cko group: health mice; APko group: mice with pulp exposure-induced apical periodontitis; LFko group: mice with liver fibrosis induced; AP+LFko group: mice with LF and AP. LF was induced by chemical method. Carbon tetrachloride (CCl4) was administered at a dosage of 0.2 ml/100g of body weight, twice a week, intraperitoneally, and throughout the experiment (60 days). Thirty days after the start of drug administration, AP was induced through pulp exposure of the upper and lower left first and second molars. After another 30 days, the mice were euthanized and the jaws, as well as the livers, were collected for light microscopy analysis. The liver tissue was analyzed using Hematoxylin-Eosin (H&E) and Picrosirius Red (PSR) staining to verify the degree of liver fibrosis. The jaws were processed for histological analysis in H&E. The livers and jaws were subjected to immunohistochemical analysis for NLRP3, IL-1β, IL-18, IL-17 and CD20. The results obtained were analyzed and compared using specific statistical tests for each case with a significance level of 5% (P <0.05). In the jaws, periapical inflammation was more severe in wt animals with differences between the APwt and APko, AP+LFwt and AP+LFko groups, and between APwt and AP+LFwt (P <0.05). There was no difference between the APko and AP+LFko groups (P >0.05). Regarding periapical bone resorption, wt animals presented larger periapical lesions when compared to ko mice (P <0.05), with differences between the APwt and APko groups, AP+LFwt and AP+LFko, APwt and AP+LFwt, and between APko and AP+LFko (P <0.05). Immunolabeling for NLRP3 in ko animals was absent in all groups. The analysis revealed greater immunolabeling of IL-1β, IL-17, IL-18 and CD20 in wt animals with differences between the APwt and APko groups (P <0.05). There was a difference between the APwt and AP+LFwt groups for NLRP3, IL-1β, IL-17 and CD20 (P <0.05). There was no difference in immunolabeling between the APko and AP+LFko groups (P >0.05). In the livers, hepatic inflammation was more severe in wt animals compared to ko and between LFwt and AP+LFwt (P <0.05). There was no difference between the LFko and AP+LFko groups (P >0.05). The stage of liver fibrosis was more pronounced in wt animals compared to ko (P < 0.05). There was no difference between the LFwt and AP+LFwt, LFko and AP+LFko groups (P >0.05). Immunohistochemistry revealed greater immunolabeling of IL-1β, IL-17, IL-18 and CD20 in wt animals compared to ko (P <0.05). There was a difference between the LFwt and AP+LFwt groups (P <0.05) for NLRP3 and IL-17. There was no difference in immunolabeling between the LFko and AP+LFko groups (P >0.05). It is concluded that silencing of the NLRP3 inflammasome plays an important role in modulating AP and LF, reducing the inflammatory process and the inflammatory mediators involved in both isolated and associated changes. Furthermore, it was evident that NLRP3 and IL-17 are involved in the bidirectional mechanism of both diseases.