Imobilização de glucoamilase fúngica comercial em suportes obtidos por manufatura aditiva e aplicação na hidrólise do amido em reator de tanque agitado operado em batelada

Abstract

O presente trabalho teve como objetivo realizar a imobilização covalente de glucoamilase fúngica comercial em suportes obtidos por manufatura aditiva e posterior aplicação dos derivados na hidrólise do amido em reatores enzimáticos. Suportes de poli-ácido lático (PLA) e de geopolímero, inéditos no contexto das glucoamilases, foram utilizados na imobilização da enzima. Os suportes de PLA foram funcionalizados com grupamentos amino a partir de dois diferentes agentes, separadamente: hexametilenodiamina (HMDA) e etilenodiamina (EDA). Os suportes de geopolímero foram funcionalizados com 3-aminopropil trietoxisilano (APTES). Foram avaliados a influência do pH de imobilização e do carregamento enzimático (fixado em 10 e 200 mg de proteína/g de suporte) e os derivados foram caracterizados físico-quimicamente. Planejamentos experimentais do tipo DCCR foram empregados visando a determinação do pH e da temperatura ótimos da enzima solúvel e dos derivados. O pH ótimo determinado para a enzima em sua forma solúvel (4,93) não sofreu alteração após a imobilização em suportes de geopolímero, enquanto que a imobilização em suportes de PLA funcionalizados com EDA contribuiu para uma ligeira alteração (pH 5,5). Por outro lado, a temperatura ótima de atividade manteve-se a mesma para a enzima solúvel e após a imobilização em suportes de PLA (50 °C) enquanto que a imobilização em suportes de geopolímero contribuiu para uma ligeira alteração deste valor para 55,5 °C). A imobilização em suportes de geopolímero contribuiu para uma elevação da estabilidade e do tempo de meia-vida frente ao seu pH ótimo de atividade (Kd = 0,01 h-1 e t1/2 = 101,93 h), o mesmo não tendo sido observado após a imobilização em suportes de PLA (Kd = 0,11 h-1 e t1/2 = 6,59 h), enquanto que a estabilidade frente às temperaturas ótimas de ambos os derivados obtidos (PLA e geopolímero) foi inferior à demonstrada pela enzima em sua forma solúvel (KdPLA = 1,36 h-1 e t1/2PLA = 0,51 h; KdGeop. = 1,77 h-1 e t1/2Geop = 0,40 h). Os derivados foram utilizados por cinco ciclos de hidrólise em reatores de tanque agitado, com destaque para as conversões próximas às máximas obtidas pelo uso dos derivados obtidos a partir da imobilização em suportes de PLA em seis horas de reação (93,44%) e em 24 horas para os derivados obtidos a partir da imobilização em suportes de geopolímero (91,55%). Os resultados obtidos demonstram o potencial de aplicação dos suportes de PLA e de geopolímero para a imobilização de glucoamilase, fornecendo opções promissoras para a hidrólise do amido em reatores enzimáticos, facilitando o reuso de biocatalisadores. Esta característica é inatingível com as enzimas em sua forma solúvel, além de contribuir para a sustentabilidade e eficiência dos processos enzimáticos industriais.

This study aimed to covalently immobilize commercial fungal glucoamylase onto supports obtained through additive manufacturing, and subsequently apply the derivatives to starch hydrolysis in enzymatic reactors. Poly-lactic acid (PLA) and geopolymer supports, novel in the context of glucoamylases, were used for enzyme immobilization. PLA supports were functionalized with amino groups using two different agents, separately: hexamethylenediamine (HMDA) and ethylenediamine (EDA). Geopolymer supports were functionalized with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). The influence of immobilization pH and enzyme loading, fixed at 10 and 200 mg protein/g support, was evaluated, and the derivatives were physicochemically characterized. DCCR experimental designs were employed to determine the optimal pH and temperature of the soluble enzyme and derivatives. The optimal pH determined for the enzyme in its soluble form (4.93) did not change after immobilization on geopolymer supports, while immobilization on PLA supports functionalized with EDA contributed to a slight change (pH 5.5). On the other hand, the optimal activity temperature remained the same for the soluble enzyme and after immobilization on PLA supports (50 °C), while immobilization on geopolymer supports contributed to a slight change in this value to 55.5 °C. Immobilization on geopolymer supports contributed to an increase in stability and half-life at its optimal pH (Kd = 0.01 h-1 and t1/2 = 101.93 h), which was not observed after immobilization on PLA supports (Kd = 0.11 h-1 and t1/2 = 6.59 h), while stability at the optimal temperatures of both derivatives obtained (PLA and geopolymer) was lower than that demonstrated by the enzyme in its soluble form (KdPLA = 1.36 h-1 and t1/2PLA = 0.51 h; KdGeop. = 1.77 h-1 and t1/2Geop= 0.40 h). The derivatives were used for five hydrolysis cycles in stirred-tank reactors, with emphasis on conversions close to the maximum obtained using the derivatives obtained from immobilization on PLA supports in six hours of reaction (93.44%) and in 24 hours for the derivatives obtained from immobilization on geopolymer supports (91.55%). The results obtained demonstrate the potential application of PLA and geopolymer supports for the immobilization of glucoamylase, providing promising options for starch hydrolysis in enzymatic reactors, facilitating the reuse of biocatalysts. This characteristic is unattainable with enzymes in their soluble form, and also contributes to the sustainability and efficiency of industrial enzymatic processes.