Uso de técnicas simples e da análise genética para determinação de persistência e dominância de leveduras em processos fermentativos

Abstract

A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada em processos fermentativos, pois é capaz de converter eficientemente os açúcares presentes no meio de cultivo em álcool. Esta conversão permite a produção de biocombustíveis como o etanol, e a produção de bebidas alcoólicas, como vinho, cerveja e cachaça. Durante a fermentação, as leveduras são expostas a estresses alcoólico, osmótico, nutricional, térmico e ácido. Esses estresses induzem o aparecimento de mutações, causando instabilidade no processo fermentativo. O reciclo celular durante as fermentações sucessivas agravam o ecossistema do processo através de contaminação por bactérias e consequentemente competição entre espécies e pelo substrato, porém o reuso celular diminui o tempo e o custo das fermentações. A garantia de que o inóculo starter estará presente durante as fermentações é outro aspecto de relevância nas indústrias, pois a dominância e persistência da levedura inoculada garante maior reprodutibilidade do processo. Técnicas simples de monitoramento de leveduras em processos fermentativos ainda não foram bem definidas por isso, um screening de corantes em meios sólidos e meios de indução de esporulação foram utilizados na busca de identificar instabilidade fenotípica das linhagens inoculadas durante as várias etapas do processo fermentativo. A partir desse screening, obteve-se o desenvolvimento de meios sólidos que permitiram identificar diferentes linhagens de leveduras com base nas diferentes pigmentações das colônias. O seu uso durante as fermentações simples e mistas permitiu monitorar a estabilidade fenotípica das leveduras inoculadas bem como acompanhar a proporção de linhagens dominantes e persistentes no processo. Essa técnica de monitoramento foi aplicada aos processos fermentativos de produção de etanol a partir do melaço de cana-de-açúcar e de produção de vinho a partir de mosto natural de uva. A sua capacidade de monitorar diferentes linhagens inoculadas em consórcio e em diferentes processos fermentativos foi validada através da técnica molecular interdelta. Comparações entre os perfis polimórficos das culturas estoques com os das colônias crescidas nos meios sólidos cromogênicos resultaram em bandas idênticas. Com isso, a identificação de leveduras por meio da coloração de colônias demonstrou ser altamente viável para elucidar a dinâmica populacional quanto à persistência e dominância de linhagens starters em processos fermentativos.

Saccharomyces cerevisiae is the most used yeast in fermentation processes because it is able to efficiently convert the sugars present in the medium into alcohol. This conversion allows the production of biofuels such as ethanol, and the production of beverages such as wine, beer and cachaça. During fermentation, yeasts are exposed to several stresses such as alcoholic, osmotic, nutritional, thermal and acid, which could induce the appearance of mutations causing instability in the fermentation process. Cell recycling aggravates the ecosystem of the process during successive fermentations due to the high concentration of contaminants, especially bacteria, which lead to a competition among species for substrate. However, it is know that cell reuse reduces time and cost of fermentation. Another relevant issue in industrial processes is the maintenance and survival of the starter inoculum during the whole fermentation, where dominance and persistence of the inoculated yeast ensures greater reproducibility of the process. Simple yeast monitoring techniques in fermentation processes have not been well defined due to this dynamic population. In the present work, a screening of dyes used in solid media and sporulation induction media were carried out in order to identify phenotypic instability of strains inoculated during the various stages of fermentation. It was possible to obtain a solid medium capable of identifying different yeast strains based on the difference of the colony pigmentation. Its use during the simple and mixed fermentation would enabled monitor the phenotypic stability of starter yeasts and the proportion of dominant and persistent strains along the process. This monitoring technique was applied to ethanol fermentation using sugarcane molasses and to wine production from natural grape must and validated by interdelta molecular technique. Comparisons between the polymorphic profiles of cultures stocks with the colonies grown on solid media chromogenic resulted in identical bands. Thus, the identification of yeast colonies by coloration proved to be highly feasible to elucidate the population dynamics as persistence and dominance of the starters strains in fermentation processes.