Efeito da estocagem de diferentes amostras clinicas de pacientes com paracoccidioidomicose na reprodutibilidade de testes diagnósticos
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Data
2022-07-21
Autores
Orientador
Mendes, Rinaldo Poncio 
Sylvestre, Tatiane Fernanda
Coorientador
Pós-graduação
Doenças Tropicais - FMB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Introdução. O teste de imunodifusão dupla em gel de ágar (IDD) é utilizado no diagnóstico sorológico, na avaliação de gravidade e no seguimento de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM). Um banco de amostras biológicas, associado ao registro de dados clínicos, permite o desenvolvimento de pesquisas em menor tempo, principalmente de doenças com baixa incidência anual. Este estudo teve dois objetivos: 1) comparar os títulos de anticorpos séricos determinados por ocasião de sua coleta (teste) e após descongelamento (reteste), avaliando a influência da estocagem a -80oC por diferentes períodos; 2) comparar os títulos obtidos em soro e plasma e avaliar a influência da estocagem por até 6 meses em freezer a -20oC . Métodos. O estudo foi realizado em pacientes com PCM confirmada, utilizando-se a IDD realizada com antígeno filtrado de cultura do P. brasiliensis B339. No primeiro experimento, os níveis de anticorpos foram determinados em 160 amostras de soro de pacientes com a forma crônica (FC) e 20 com a forma aguda/subaguda (FA), estocadas há mais de seis meses; no reteste, o executor não foi o mesmo e o antígeno foi preparado com a mesma cepa, mas não provinha do mesmo lote utilizado no teste. No segundo experimento, foram avaliadas 81 amostras de soro e plasma com EDTA ou com heparina de 27 pacientes, para comparação das diferentes matrizes sanguíneas e avaliação do efeito da estocagem por 6 meses; neste estudo, o executor e lote do antígeno foram os mesmos. Foram consideradas discordantes as diferenças de títulos maiores que uma diluição. Utilizaram-se os testes de Kruskal-Wallis, Friedman, Marascuilo, qui-quadrado e de Goodman e o coeficiente de correlação de Spearman, admitindo-se p≤0,05 para indicar diferença significante. Resultados. No primeiro experimento, a comparação dos títulos iniciais com os obtidos após descongelamento revelou medianas com diferença de uma diluição. Na discordância de títulos observou-se: a) presente em 30% das amostras da FA e 18% da FC (p=0,13); b) ausente em soros estocados por até 3 anos e presente em frequência crescente com o tempo de estocagem – 3 a 6 anos e ≥7 anos (p=0,003). No segundo experimento, os títulos observados em soro, plasma-EDTA e plasma-heparina não diferiram entre si e apresentavam correlação positiva. Além disso, a estocagem por até 6 meses não interferiu nas titulações em nenhuma das três matrizes sanguíneas avaliadas. Conclusões. A estocagem a -80oC por até seis anos pouco influiu na dosagem de anticorpos séricos por IDD, permitindo sua utilização segura em estudos que dependam de sua avaliação. A concordância entre titulações realizadas em soro e plasma sugere que se mantenha o biorrepositório em amostras de soro, matriz que vem sendo utilizada há muitos anos. Porém, estudos sobre estocagem por pelo menos sete anos em matrizes sanguíneas de plasma são necessárias para avaliar se os títulos são mais preservados do que se observou no soro.
Resumo (inglês)
Introduction. The serological evaluation performed by the double agar gel immunodiffusion test (DID) is used for diagnosis, evaluation of severity, and management of paracoccidioidomycosis (PCM) patients. A bank with biological samples, associated to clinical data, permit the development of research in shorter time, mainly when the disease presents lower annual incidence. This study was performed with two objectives: 1) to compare titration of serum antibodies determined in the day it was drawn (test) and after a long-term storage at -80oC (retest), evaluating its influence; 2) to compare the titration determined in serum and plasma and to evaluate the influence of the storage during up to six months at -20oC. Methods. The study was performed in patients with confirmed PCM, and DID was performed with culture filtrate from Paracoccidioides brasiliensis B339 as antigen. In the first experiment, the antibody levels were determined in serum samples from 160 patients with the chronic form (CF) and 20 with the acute/subacute form (AF); the storage was frozen for more than six months; the retest (Rt) was carried out by another operator; and the antigen, which did not belong to the same batch, was prepared with the same strain and method. In the second experiment, 81 samples of serum and plasma with ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) or heparin, from 27 patients, were tested to evaluate the reproducibility of the antibody levels among the three blood matrices, as well as the effect of the storage up to six months at -20oC. This study was performed by the same operator, using antigen from a single batch number. Differences of titration higher than one dilution were considered discordant. The statistical analyses were performed by the tests of Kruskal-Wallis, Friedman, Marascuilo, chi-square and Goodman, and the correlation coefficient of Spearman; significance was set up at p≤0.05. Results. The first experiment showed that the test (T) and retest (Rt) presented no difference in titration; however, Rt<T in the AF, and Rt>T in the CF , both with one dilution of difference. The discordance of titration was (a) present in 30.0% of the samples from the AF, and in 18% of those from the CF (p=0,13); (b) absent in serum samples under storage up to 3 years, and present in increasing incidence in serum samples frozen for ≥4 years: 4 – 6 years and ≥7 years (p=0,003). The second experiment demonstrated that the titration observed in samples of serum, plasma-EDTA and plasma-heparin samples did not differ from each other, and presented direct correlation. In addition, the storage for up to 6 months did not interfere on the titration in any of the three blood matrices evaluated. Conclusions. The storage at -80oC for up to six years has little influence on the dosage of antibody serum levels determined by DID, permitting its safe use in studies that depend on this parameter. The concordance among the titration performed in serum, plasma-EDTA, and plasma-heparin suggest the maintenance of the biobank in the matrix serum, which has been used for many years. However, studies on storage for at least seven years in plasma matrices are mandatory to evaluate if the titration will be preserved.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português