Etiologia microbiana de infecções umbilicais em bezerros e fatores de virulência extraentéricos em isolados de Escherichia coli
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Data
2022-05-06
Orientador
Ribeiro, Márcio Garcia 
Coorientador
Pós-graduação
Medicina Veterinária - FMVZ
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
As infecções umbilicais em bezerros apresentam etiologia complexa e representam uma das principais causas de prejuízos ao produtor decorrentes de complicações como poliartrite, pneumonia, abscessos em órgãos, septicemia e consequente alta mortalidade neonatal, descarte prematuro e reposição de animais. Número restrito de estudos tem investigado a complexidade etiológica das infecções umbilicais em bezerros com base no diagnóstico molecular e a multirresistência dos isolados aos antimicrobianos, tampouco o perfil de genes extraentéricos (ExPEC) de Escherichia coli associados a virulência do patógeno nas onfalopatias de origem infecciosa. Foram colhidas 150 amostras umbilicais de bezerros (idade média de 9,4 dias) de 27 propriedades leiteiras de quatro estados do Brasil. As infecções umbilicais foram classificadas clinicamente em escores grau 1 (leve), 2 (moderada) e 3 (grave). Todas as secreções umbilicais foram submetidas ao cultivo microbiológico, teste de sensibilidade microbiana in vitro dos isolados e diagnóstico dos micro-organismos, em nível de espécie, por espectrometria de massas (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS). Os isolados de E. coli foram submetidos ao diagnóstico de 16 genes relacionados a fatores de virulência (FV) ExPEC, a saber: fímbrias/adesinas (sfaDEa, papA, papC, afaBC), toxinas (hlyA, sat, cnf1, cdt), sideróforos (iroN, irp2, iucD, ireA), invasinas (ibeA) e mecanismos de resistência ao soro (ompT, traT, kpsMTII). Foram isoladas 231 linhagens de micro-organismos, das quais 82,3% (190/231) de origem bacteriana e 17,7% (41/231) fungos e leveduras. Os principais grupos/gêneros de patógenos foram enterobactérias (105/190=55,3%), estafilococos (19/190=10%), Pseudomonas spp. (13/190=6,8%), Enterococcus spp. (8/190=4,2%), estreptococos (7/190=3,7%) e actinomicetos (7/190=3,7%). Aspergillus fumigatus (15/41=36,6%), Aspergillus niger (10/41=24,4%) e Aspergillus terreus (8/41=19,5%) foram os fungos mais frequentes. E. coli (27/72=37,5%), Staphyloccus sciuri (4/72=5,5%) e Enterobacter xiangfangensis (3/72=4,2%) foram os principais micro-organismos isolados em cultura pura, enquanto Aerococcus viridans + Candida catenulata (2/72=2,9%); Escherichia coli + Aspergillus fumigatus (2/72=2,9%); Escherichia coli + Aspergillus terrus (2/72=2,9%); Escherichia coli + Proteus vulgaris (2/72=2,9%) foram as principais associações de agentes. Marbofloxacino (128/190=67,4%), amoxicilina/ácido clavulânico (121/190=63,7%) e gentamicina (112/190=58,9%) foram os antimicrobianos mais efetivos. Em contraste, os isolados apresentaram maior resistência para sulfametoxazol/trimetoprim (159/190=83,7%), ampicilina (114/190=60%) e tetraciclina (101/190=53,1%). Resistência simultânea ≥3 classes de antimicrobianos foi identificada em 83,7% (159/190) dos isolados. Os escores de gravidade clínica das infecções umbilicais graus 1, 2 e 3 foram identificados em 34% (51/150), 34% (51/150) e 32% (48/150) dos animais, respectivamente. Nos bezerros com isolamento de E. coli, foram identificados escores de gravidade 1, 2 e 3 em, respectivamente, 32,2% (19/59), 23,7% (14/59) e 44,1% (26/59) animais. Foi possível obter informações de complicações relacionadas as infecções umbilicais de 21 animais até idade da desmama (45 dias, em média), dos quais 9,5% (2/21) desenvolveram emagrecimento progressivo, 19,1% (4/21) poliartrite e 28,6% (6/21) evoluíram para óbito. Os principais genes codificadores de FV detectados nos isolados de E. coli foram resistência ao soro (traT, 42/59=72,2%; ompT, 35/59=59,3%, kpsMTII 10/59=17%), invasinas (ibeA 11/59=18,6%), fímbrias/adesinas (papA, 8/59 = 13,6%; papC 15/59 = 9,59%) e sideróforos (iroN 8/59 = 13,6%; iucD 9/59 = 15,3%). A associação entre os genes ompT e traT foi a mais frequente nos animais com escores de gravidade 1 (4/17=23,5%) e 2 (2/14=14,3%), enquanto iroN e traT (2/25=8%), e ibeA, ompT e traT (2/25=8%) foram frequentes em casos de gravidade 3. Não houve diferença estatística (p=0,062) entre a detecção dos diferentes genes ExPEC e os escores de gravidade clínica dos casos. Infere-se a elevada complexidade etiológica nas onfalopatias de origem infecciosa em bezerros, a multirresistência dos isolados aos antimicrobianos convencionais e complicações clínicas secundárias às infecções umbilicais, com alta mortalidade (28,6%); reforçando a importância da antissepsia umbilical nos primeiros dias após o nascimento dos bezerros, bem como o uso racional de antimicrobianos no tratamento dos casos. A detecção de genes ExPEC e associação com escores de gravidade clínica dos casos foi investigada pela primeira vez em bezerros com infecções umbilicais. A elevada identificação de traT (72,2%) e ompT (59,3%) indica que estes genes relacionados a resistência ao soro possam ser utilizados como biomarcadores de gravidade das infecções umbilicais em bezerros neonatos. Os resultados do presente estudo contribuem com a caracterização etiológica, da resistência múltipla dos isolados aos antimicrobianos e a presença de genes extraentéricos relacionados a virulência de E. coli, em bezerros com infecções umbilicais.
Resumo (inglês)
Umbilical infections in calves are characterized by the high complexity of etiology and represent one of the main causes of losses to dairy farmers due to the development of complications, e.g., polyarthritis, pneumonia, organ abscesses related to secondary premature disposal, animal replacement, and high neonatal mortality. A restrict number of studies have investigated the etiology of the disease based on molecular methods, the multidrug resistance of isolates to conventional antimicrobials, as well as the presence of extraintestinal Escherichia coli (ExPEC) genes related to the virulence of the pathogen. A total of 150 specimens of umbilical infections in calves were collected (mean age of 9.4 days) from 27 dairy farms of the four states from Brazil. Umbilical infections were clinically classified as scores 1 (mild), 2 (moderate), and 3 (severe). All the specimens were subjected for microbiological culture, in vitro antimicrobial susceptibility test of the isolates, and diagnosis of microorganisms at the species level based on Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). All E. coli isolates were submitted to molecular diagnosis of 16 extraintestinal virulence-associated genes, as follow: fímbriae/adhesin (sfaDEa, papA, papC, afaBC), toxins (hlyA, sat, cnf1, cdt), siderophores (iroN, irp2, iucD, ireA), invasins (ibeA), and mechanisms of serum resistance (ompT, traT, kpsMT II). Two hundred and thirty microorganisms were isolated, of which 82.6% (190/230) were from bacterial origin and 17.7% (41/231) fungi or yeasts. Enterobacteria (105/190=55.3%), staphylococci (19/190=10%), Pseudomonas spp. (13/190=6.8%), Enterococcus spp. (8/190=4.2%), streptococci (7/190=3.7%), and actinomycetes (7/190=3.7%) were the main groups/genus of the pathogens identified. Aspergillus fumigatus (15/41=36.6%), Aspergillus niger (10/41=24.4%) and Aspergillus terreus (8/41=19.5%) were the most frequent fungi. E. coli (27/72=37.5%), Staphyloccus sciuri (4/72=5.5%) and Enterobacter xiangfangensis (3/72=4.2%) were the main microorganisms identified in pure culture, whereas Aerococcus viridans + Candida catenulata (2/72=2.9%); Escherichia coli + Aspergillus fumigatus (2/72=2.9%); Escherichia coli + Aspergillus terréus (2/72=2.9%); Escherichia coli + Proteus vulgaris (2/72=2.9%) in coinfections. Marbofloxacin (128/190=67.4%), amoxicillin/clavulanic acid (121/190=63.7%), and gentamicin (112/190=58.9%) were the most effective antimicrobials. Conversely, the isolates showed higher resistance to sulfamethoxazole/trimethoprim (159/190=83.7%), ampicillin (114/190=60%), and tetracycline (101/151=53.1%). Among the isolates studied, 83.7% (159/190) showed simultaneous resistance ≥3 groups of antimicrobials (multidrug-resistant). Clinical severity scores 1, 2, and 3 of all umbilical infections were identified in 34% (51/150), 34% (51/150), and 32% (48/150) of the animals, respectively. Particularly with E. coli isolation, clinical gravity scores 1, 2, and 3 were observed in 32.2% (19/59), 23.7% (14/59), and 44.1% (26/59) animals, respectively. Clinical complications secondary to umbilical infections were available in 21 calves (~45 days), of which 9.5% (2/21) developed progressive weight loss, 19.1% (4/21) polyarthritis, and 28.6% (6/21) died. The main virulence-associated genes encoded were serum resistance (traT, 42/59=72.2%; ompT, 35/59=59.3%, kpsMTII, 10/59=17%), invasins (ibeA, 11/59=18.6%), adhesins (papA, 8/59=13.6%; papC, 15/59=9.59%), and siderophores (iroN, 8/59=13.6%; iucD, 9/59=15, 3%). The main associations of genes were found between ompT and traT among calves with severity 1 (4/17=23.5%) and 2 (2/14=14.3%), whereas iroN and traT (2/25=8%), and ibeA, ompT and traT co-occurrence (2/25=8%) were the most common in cases score 3. Nonetheless, no significance difference (p=0.062) was observed between the ExPEC genes identification and the clinical severity scores of the cases. Here, a high etiological complexity of agents related to umbilical infections in calves, the multidrug resistance of isolates, in addition to clinical complications, i.e., high mortality rates (28.6%), highlight the need for umbilical antisepsis of neonatal calves and rational use of antimicrobials in therapeutic approaches. Furthermore, the virulence associated ExPEC genes were investigated for the first time among calves, where scores of clinical severities of umbilical infections were assessed. The high prevalence of traT (72,2%) and ompT (59,3%) indicates that these serum resistance-related genes could be used as biomarkers to further studies of ExPEC for umbilical infections of neonatal calves. Results of this study contribute to the etiological characterization, antimicrobial resistance pattern, and virulence mechanisms of ExPEC involved in umbilical infections of calves.
Descrição
Idioma
Português