Imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter Asiaticus em citros

Abstract

A citricultura é um dos setores mais bem organizados da agroindústria brasileira, dispondo de fundações empresariais de assessoria e monitoramento da produção e da qualidade dos citros. Atualmente a produção brasileira está concentrada no denominado de cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais, região geográfica que engloba 481 municípios e 12 mil fazendas, totalizando uma área plantada de mais de 400 mil hectares, sendo responsável por 60% da produção mundial de suco de laranja. Entanto, a citricultura vem enfrentando alguns desafios em função da disseminação de diferentes doenças, das quais podemos ressaltar o Huanglongbing (HLB) também nomeada “greening”, que é provocada pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus as quais são transmitidas para as plantas pelo psilídeo Diaphorina citri. A detecção de plantas contaminadas com “greening” no pomar ocorre de forma visual e geralmente subjetiva e os métodos laboratoriais existentes demandam tempo de análise e elevado custo financeiro. Desta maneira, no presente trabalho desenvolveu-se um imunossensor impedimétrico seletivo para a detecção e determinação de HLB em amostras de citros. O anticorpo anti-HLB, obtido comercialmente a partir da proteína de membrana externa (OMP), foi imobilizado sobre nanopartícula magnética previamente sintetizada e caracterizada. O anticorpo devidamente imobilizado foi colocado em contato com as diferentes amostras de extratos de folhas de plantas cítricas, após a reação de afinidade com o antígeno realizou-se a etapa de lavagem do material para minimizar o efeito de matriz. O monitoramento da reação de afinidade foi efetuado por espectroscopia de impedância eletroquímica, empregando como eletrodo de trabalho o carbono vítreo contendo em seu interior um imã de neodímio. O dispositivo desenvolvido distingue as amostras positivas ao HLB das amostras negativas ao HLB e das positivas ao CTV. Os resultados obtidos pelo imunossensor impedimétrico corroboraram os dados alcançados pela técnica equivalente a técnica “padrão ouro” qPCR.

Citrus farming is one of the best-organized sectors of the Brazilian agroindustry, with business foundations for advising and monitoring citrus production and quality. Currently the Brazilian production is concentrated in the so-called citrus belt of São Paulo and Minas Gerais, a geographic region that encompasses 481 municipalities and 12,000 farms, totaling a planted area of over 400,000 hectares, accounting for 60% of world production of orange juice. However, citrus farming has been facing a decline in productivity and quality of the fruits generated due to the spread of different diseases, of which we can highlight Huanglongbing (HLB) also known as “greening”, which is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanas, which are transmitted to plants by the psyllid Diaphorina citri. The detection of plants contaminated with “greening” in the crop occurs visually and is generally subjective, and existing laboratory methods demand analysis time and high financial cost. Thus, the present work developed a selective impedimetric immunosensor for the detection and determination of HLB in citrus samples. The anti-HLB antibody, obtained commercially from the outer membrane protein (OMP), was immobilized on a previously synthesized and characterized magnetic nanoparticle. The immobilized antibody was placed in contact with different samples of extracts of citrus plant leaves, after the affinity reaction with the antigen, material was washed to minimize the matrix effect. The monitoring of the affinity reaction was carried out by electrochemical impedance spectroscopy, using glassy carbon containing the neodymium magnet as the working electrode. The developed device distinguishes HLB-positive samples from HLB- negative samples and CTV-positive ones. The results obtained by the impedimetric immunosensor corroborated the data obtained by the technique equivalent to the “gold standard” technique qPCR.