Abordagens bionalíticas baseadas em peptídeo recombinante selecionado por Phage Display visando a detecção e caracterização de câncer de mama

Abstract

O câncer de mama (CM) é o tumor maligno mais comum na população mundial. Assim, métodos mais precisos e que detectem a doença precocemente são necessários, de modo que técnicas inovadoras como o Phage Display (PD) vêm sendo amplamente exploradas. Nesse contexto, a construção de sensores biológicos e imunoensaios do tipo ELISA baseados em peptídeos ligantes selecionados por PD se mostra como uma promissora alternativa no desenvolvimento de novas abordagens bioanalíticas, sendo que estas se destacam pela sensibilidade e seletividade. Esta Tese, portanto, em consonâncias com as atuais demandas da área oncológica, objetivou desenvolver novas metodologias bioanalíticas voltadas para o CM. No Capítulo II, uma nova matriz para o acoplamento de biomoléculas na superfície de eletrodos de grafite de lapiseira (PGEs) foi gerada através da modificação eletroquímica com um novo material derivado do ácido 3-(3-aminofenil)propiônico (3-3-AAFP). Foram realizadas caracterizações eletroquímicas e morfológicas, sendo proposto o mecanismo de eletropolimerização do poli(3-3-AAFP), no qual os grupos carboxilato são mantidos na estrutura do polímero formado. Um novo teste ELISA e um biossensor eletroquímico, foram testados com o soro de pacientes diagnosticados com CM ou doença benigna da mama (DBM), visando detectar antígenos circulantes, ambos utilizando o peptídeo Biotina-H2 ou Biotina-C3. Foram plotadas curvas ROC, sendo para cada resultado significativo e realizados os cálculos da análise de desempenho, para os testes ELISA e o biossenssor, respectivamente. O peptídeo Biotina-H2 apresentou um desempenho inferior (AUC de 0,677 e 0,806) comparado ao peptídeo Biotina-C3 que, além de manter o potencial diagnóstico (AUC de 0,771 e 0,951), caracterizou CM luminal de acordo com o status p53 (AUC de 0,886 e 0,748) e a expressão de HER2 (AUC de 0,748 e 0,833), sendo o biossensor uma melhor estratégia quando comparado ao teste ELISA. Além disso, no Capítulo III, por meio de um estudo proteômico, foram identificados 38 possíveis alvos para o peptídeo Biotina-C3, sendo estes presentes em membrana plasmática e membranas de organelas celulares, principalmente de mitocôndrias. Visando a detecção e caracterização de exossomos derivados de linhagens celulares de CM, ensaios de citometria de fluxo foram conduzidos. Para isso, exossomos imobilizados diretamente em partículas magnéticas e indiretamente em partículas magnéticas modificadas com anticorpos anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81 foram utilizados para validar a capacidade do peptídeo Biotina-C3 de se ligar aos exossomos. Estes também foram detectados por magneto-ELISA e por biossensor eletroquímico magnético, com LODs menores para a linhagem MCF-7, sendo (LOD magneto-ELISA de 330 exossomos μL−1) e (LOD Biossensor de 175 exossomos μL−1) em comparação com as outras linhagens celulares. A detecção de exossomos derivados da linhagem Luminal (MCF-7), em soro humano foi realizada com sucesso, e a combinação de partículas magnéticas modificadas com anti-CD63, seguida da detecção baseada no peptídeo Biotina-C3 proporcionou resultados promissores em termos de especificidade e recuperação, para o teste ELISA (108,8%) e para o Biossensor (111,9%). Estas novas abordagens bionalíticas permitirão o desenvolvimento de novas plataformas rápidas e inovadoras para a caracterização do CM e seus subtipos moleculares.

Breast cancer (BC) is the most common malignant tumor in the world population. Therefore, more precise methods that can detect the disease early are needed, and innovative techniques such as Phage Display (PD) have been extensively explored. In this context, the construction of biological sensors and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) based on PD-selected binding peptides emerges as a promising alternative in the development of new bioanalytical approaches, notable for their sensitivity and selectivity. This thesis, therefore, aimed to develop new bioanalytical methodologies focused on BC in line with the current demands of the oncology field. In Chapter II, a novel matrix for coupling biomolecules onto the surface of pencil graphite electrodes (PGEs) was generated through electrochemical modification using a new material derived from 3-(3-aminophenyl)propionic acid (3-3-AAFP). Electrochemical and morphological characterizations were performed, and the electro-polymerization mechanism of poly(3-3-AAFP) was proposed, in which carboxylate groups are retained in the structure of the formed polymer. A new ELISA test and an electrochemical biosensor were tested with serum samples from patients diagnosed with BC or benign breast disease (BBD) to detect circulating antigens, both using the peptide Biotein-H2 or Biotin-C3. ROC curves were plotted, and performance analysis calculations were carried out for the ELISA test and the biosensor, respectively. The peptide Biotin-H2 exhibited inferior performance (AUC of 0.677 and 0.806) compared to the peptide Biotin-C3, which maintained diagnostic potential (AUC of 0.771 and 0.951) and characterized luminal BC according to p53 status (AUC of 0.886 and 0.748) and HER2 expression (AUC of 0.748 and 0.833). The biosensor proved to be a better strategy when compared to the ELISA test. Additionally, in Chapter III, a proteomic study identified 38 potential targets for the Biotin-C3 peptide, predominantly present in the plasma membrane and cellular organelle membranes, especially mitochondria. Flow cytometry assays were conducted to detect and characterize exosomes derived from BC cell lines. For this purpose, exosomes immobilized directly on magnetic particles and indirectly on magnetic particles modified with anti-CD9, anti-CD63, and anti-CD81 antibodies were used to validate the binding capacity of the Biotin-C3 peptide to exosomes. They were also detected by magnetic ELISA and magnetic electrochemical biosensor, with lower limits of detection (LOD) for the MCF-7 cell line (LOD of 330 exosomes μL−1 for magnetic ELISA and LOD of 175 exosomes μL−1 for the biosensor) compared to other cell lines. Successful detection of exosomes derived from the Luminal cell line (MCF-7) in human serum was achieved, and the combination of anti-CD63-modified magnetic particles followed by detection based on the Biotin-C3 peptide provided promising results in terms of specificity and recovery for the ELISA test (108.8%) and the biosensor (111.9%). These new bioanalytical approaches will enable the development of rapid and innovative platforms for the characterization of BC and its molecular subtypes.