Estudos biofísicos da hemocianina do camarão Macrobachium acanthurus (HcMac) na presença de agentes caotrópicos e atividade biológica

Abstract

As hemocianinas (Hcs) são grandes proteínas extracelulares responsáveis por inúmeras funções em artrópodes e moluscos. Representam cerca de 50 – 90% da hemolinfa, e tem como principais funções, o transporte de O2 e atuar no mecanismo de defesa imunológica. Em geral, as Hcs mantem sua integridade funcional e estrutural em uma ampla faixa de temperatura (entre -20 e 90ºC) e apresentam atividade fenoloxidase (PO) latente quando o animal é exposto a condições de estresse. Em artrópodes, as Hcs apresentam-se na forma de seis cadeias monoméricas agregadas, na forma de um hexâmero ou oligohexâmeros contendo até oito hexâmeros (8 × hexâmeros). Assim, o objetivo geral deste projeto de doutorado foi purificar, caracterizar, avaliar atividade biológica e PO da Hc do camarão Macrobrachium acanthurus (HcMac). Para estes estudos foram realizados cromatografia líquida de exclusão molecular, eletroforese monodimensional SDS-PAGE, AUC (do inglês Analytical Utracentrifugation), MALDI-TOF-MS (do inglês Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), medidas espectroscópicas variando o pH, concentração de ureia e SDS (dodecil sulfato de sódio), e estudos de atividade PO e antimicrobiana. Os resultados dos experimentos de SDS-PAGE, AUC e MALDI-TOF-MS indicam que a HcMac é formada por cadeias polipeptídicas de 75 - 76 kDa formando uma estrutura de 450 kDa, ou seja, um hexâmero é composto por 6 cadeias monomérica de 75 KDa (1×hexâmero). As medidas UV-vis mostraram que a afinidade do centro di-cobre pelo oxigênio é dependente do valor de pH. Os resultados de emissão de fluorescência indicaram alterações na estrutura terciária da proteína devido às mudanças do valor de pH do meio, sendo que este influenciou na exposição dos resíduos de Triptofano ao solvente. Através das análises de intensidade de espalhamento de luz (LSI – do inglês Ligth Scathering Intensity) medidas no espectrofluorímetro foi possível sugerir que a HcMac apresenta ponto isoelétrico entre 4,3 e 5,3, assim como a hemocianina de outros camarões. A ureia induziu o processo de desnaturação, mas em pH 7,0 a HcMac demonstrou ser mais estável e foi necessário uma concentração maior de desnaturante em relação ao pH 5,0. A ureia e o SDS reduziram a intensidade de fluorescência, deslocaram o comprimento de onda máximo (λmax) para valores maiores, devido ao processo de dissociação, que expôs o centro di-cobre da hemoproteína (cobre é supressor de fluorescência), além de favorecer a exposição do Triptofano ao solvente. Os resultados de LSI da HcMac mostram que em pH 5,0 houve uma forte interação entre proteína-SDS em concentrações inferiores a 1,0 mmo.L-1, pois a LSI aumentou em 12 vezes sua intensidade em relação HcMac pura em solução. A HcMac nativa apresentou atividade PO induzida pelo surfactante SDS e não demonstrou ação antimicrobiana nos testes realizados. Os resultados obtidos até o momento são relevantes, pois trazem informações importantes para avançarmos nos estudos de caracterização e aplicação biotecnológica da HcMac.

Hemocyanins (Hcs) are large extracellular proteins responsible for numerous functions in arthropods and mollusks. They represent about 50-90% of the hemolymph, and their main functions are O2 transport and immune defense mechanisms. They maintain their functional and structural integrity over a wide temperature range (between -20 and 90ºC) and exhibit latent phenoloxidase (PO) activity when the animal is exposed to stress conditions. In arthropods Hcs are presented as six monomeric chains aggregated in the form of a hexamer or oligohexamers containing up to eight hexamers (8 x hexamers). Thus, the objective this work was to perform the extraction/purification, structural characterization, evaluate biological activity and PO of Hc from Macrobrachium acanthurus shrimp (HcMac). Molecular exclusion liquid chromatography, one-dimensional SDS-PAGE electrophoresis, AUC (Analytical Utracentrifugation), MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), spectroscopic measurements varying pH and urea and SDS (sodium dodecyl sulfate) concentration, and PO and antimicrobial activity studies were performed. The results of SDS-PAGE, AUC and MALDI-TOF-MS experiments indicated that HcMac is formed by 75 - 76 kDa polypeptide chains forming a 450 kDa structure, i.e. one hexamer is composed of 6 monomeric 75 KDa chains (1×hexamer). UV-vis measurements showed that the affinity of the di-copper center for oxygen is pH value dependent. The fluorescence emission results indicated changes in the tertiary structure of the protein due to changes in the pH value of the medium, in which pH influenced the exposure of Tryptophan residues to the solvent. Through the analysis of the light scattering intensity (LSI) measured in the spectrofluorimeter, it was possible to suggest that HcMac presents an isoelectric point between 4.3 and 5.3, as does hemocyanin from other shrimp. Urea induced the denaturation process, but at pH 7.0 HcMac proved to be more stable and a higher concentration of denaturant was required compared to pH 5.0. Urea and SDS reduced the fluorescence intensity, shifted the maximum wavelength (λmax) to higher values, due to the dissociation process, which exposed the di-copper center of the hemoprotein (copper is fluorescence suppressor), and also favored the exposure of Tryptophan to the solvent. The LSI results of HcMac show that at pH 5.0 there was a strong protein-SDS interaction at concentrations lower than 1.0 mmo.L-1, as the LSI increased by a factor of 12 times its intensity compared to pure HcMac in solution. HcMac showed PO activity induced by the SDS surfactant and did not show antimicrobial action in the tests performed. The results obtained so far are relevant because they bring important information to advance the characterization studies and biotechnological application of HcMac.