Nanopartículas multifuncionais para liberação de siRNA no tratamento de doenças dérmicas: estudos em modelos in vitro e in vivo de psoríase induzida
Carregando...
Data
2024-05-21
Autores
Orientador
Tiera, Marcio José 
Coorientador
Pós-graduação
Química - IBILCE 33004153077P8
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
Ao longo da última década, os avanços na engenharia do RNA possibilitaram a geração de pequenos RNAs de interferência (siRNA) com atividade farmacológica melhorada, o que tem impulsionado um crescente número de estudos que visam utilizá-las para o desenvolvimento de plataformas terapêuticas para variadas doenças, como a psoríase. Contudo, a eficácia do tratamento terapêutico ainda está condicionada à utilização de nanocarreadores capazes de entregar de forma eficiente o siRNA no citosol das células-alvo, mediante a superação dos vários obstáculos que se iniciam no momento de sua aplicação nos sistemas biológicos. Neste estudo, foram sintetizados policátions multifuncionais baseados em quitosana para serem aplicados no desenvolvimento de duas séries de nanocarreadores de siRNAs. Na Série I, a quitosana foi substituída com grupos diisopropiletilamina (DIPEA) e tiol (-SH) e foram utilizadas para revestir nanopartículas de ouro (AuNPs), as quais foram aplicadas no transporte do siRNA. Já na Série II, as DIPEA-quitosanas foram enxertadas com polietilenoglicol tiolado (PEG-SH) para geração dos nanocarreadores de siRNA através da simples complexação dos ácidos nucleicos. A composição dos policátions foi determinada por diferentes técnicas espectrométricas (RMN 1H, FTIR e UV-Vis) e confirmadas via análise elementar (CHNS). Os derivados de quitosana apresentaram conteúdo de DIPEA variados (14-59%), tiolação entre 1-2% (Série I) e PEGuilação próxima a 1% (Série II). Em ambas as séries, os nanocarreadores de siRNA apresentaram tamanhos entre 100-200 nm e carga superficial positiva (8 a 12 mV), as quais puderam ser precisamente controladas por meio de ajustes na composição dos derivados de quitosana e pelo pH das formulações. As nanoplataformas complexaram eficientemente o siRNA, minimizando a degradação dos ácidos nucleicos pela ação dos radicais hidroxila e pelo ataque da RNAse, além de apresentarem elevada estabilidade estrutural e coloidal na presença de proteínas séricas. Adicionalmente, observou-se que os policátions liberaram o PEG-SH em ambiente redutor e apresentaram biodegradabilidade similar à da quitosana frente ao ataque da lisozima, o que embasou uma possível via de liberação intracelular do siRNA. Os vetores apresentaram baixa citotoxicidade em diferentes linhagens celulares e mediaram níveis de silenciamento de proteína verde fluorescente (GFP) em células HeLa (≤ 50%) e do fator de necrose tumoral alfa (TNFα) em macrófagos RAW (≤ 60%) similares aos alcançados pela Lipofectamina™. Formulações para uso tópico contendo os vetores da Série II aumentaram em até 4 vezes a retenção do siRNA em modelos de pele artificial (Strat-M®) e de origem animal (orelha de porco). Esses resultados foram corroborados pelos estudos in vivo em gerbilos da Mongólia (Meriones unguiculatus), que revelaram a presença de nanopartículas em diferentes camadas da epiderme/derme e indicaram que os folículos capilares são uma importante via para penetração dos nanocarreadores na pele. O uso tópico destas formulações carregadas com siRNA anti-TNFα melhoraram o aspecto geral da pele de modelos animais com psoríase induzida via Imiquimod, diminuindo a infiltração de células, a densidade de vasos sanguíneos e a concentração de TNFα no local da inflamação. Os resultados obtidos destacam o potencial dos vetores no desenvolvimento de formulações de uso tópico, em especial, aquelas voltadas para o tratamento da psoríase.
Resumo (inglês)
Over the last decade, advances in RNA engineering have enabled the generation of small interfering RNAs (siRNA) with improved pharmacological activity, which has driven a growing number of studies that aim to use them for the development of therapeutic platforms for various diseases such as psoriasis. However, the success of the therapeutic treatment still depends on the use of nanocarriers able to deliver siRNA efficiently into the cytosol of the target cells, by overcoming the various obstacles that start at the moment of its biological application. In this study, multifunctional chitosan-based polycations were synthesized and applied for the development of two series of siRNA nanocarriers. In Series I, chitosan was modified with diisopropylethylamine (DIPEA) and thiol (-SH) groups and used to coat gold nanoparticles (AuNPs), which were used to transport the siRNA. In Series II, DIPEA-chitosans were grafted with thiolated polyethylene glycol (PEG-SH) to formulate siRNA nanocarriers by a simple complexation process of nucleic acids. The composition of the polycations was determined by different spectrometric techniques (1H NMR, FTIR and UV-Vis) and confirmed by elemental analysis (CHNS). The chitosan derivatives presented varied DIPEA content (14-59%), thiolation degree between 1-2% (Series I) and PEGylation close to 1% (Series II). In both series, the siRNA nanocarriers presented 100-200 nm size ranging and positive surface charge (8 a 12 mV), which were precisely controlled by adjusting the composition of polymers and the pH of the formulations. The nanoplatforms efficiently load the siRNA molecules, reducing their degradation by hydroxyl radicals action and by RNAse attack, and formulated nanopolyplexes with high structural and colloidal stability in presence of serum proteins. In addition, the derivatives were able to release the PEG-SH coat in reducing environments and also presented a biodegradability similar to the unmodified chitosan face of lysozyme attack, which supported a possible pathway for the intracellular release of siRNA. The formulation of vectors displayed very low cytotoxicities in different cell lines and mediated knockdown levels of green fluorescent protein (GFP) in HeLa cells (up to 50%) and tumor necrosis factor alpha (TNFα) in RAW macrophages (up to 60%) similar to those achieved by Lipofectamina™. The topical formulations of the vectors from Series II increased up to 4-fold the amount of siRNA retained in artificial (Strat-M®) and animal (pig ear) skin models. These results were corroborated in vivo studies in Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus), which revealed the presence of the nanoparticles in different layers of the epidermis/dermis and indicated that the hair follicles are an important route for the penetration of nanocarriers into the skin. The topical use of these formulations loaded with anti-TNFα siRNA improved the overall appearance of the skin of animal models with Imiquimod-induced psoriasis, decreasing the infiltration of cells, the density of blood vessels and the concentration of TNFα cytokine at the inflamed tissue. The results obtained highlight the potential of the vectors in the development of formulations for topical use, especially those aimed at the treatment of psoriasis.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
MARTINEZ JUNIOR, André Miguel. Nanopartículas multifuncionais para liberação de siRNA no tratamento de doenças dérmicas: estudos em modelos in vitro e in vivo de psoríase induzida. (Doutorado em Química ). 2024. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas (Ibilce), São José do Rio Preto, 2024.