Avaliação do impacto do exercício aquático sobre a miopatia de ratas prenhes com diabetes moderado

Abstract

O Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) está relacionado à perda involuntária de urina que ocorre pela primeira vez durante a gestação, definida como incontinência urinária específica da gestação (IU-EG). A miopatia diabética gestacional (MiDG) foi evidenciada no músculo reto abdominal (MRA) de gestantes e de ratas prenhes e na uretra de ratas prenhes. A prática de exercício aquático durante a prenhez de ratas com diabetes moderado se mostrou eficaz na reversão da MiDG do MRA, porém não se sabe quais mecanismos participaram deste processo. Adicionalmente, não há estudos avaliando o impacto do exercício aquático sobre a MiDG da uretra. O objetivo deste trabalho é expandir a caracterização da reversão da MiDG e estudar o papel da miogênese, biogênese e inflamação no processo de reversão da MiDG no MRA, além de estudar o impacto do exercício na MiDG da uretra. No primeiro dia de vida de ratas de linhagem Wistar foi realizada a indução do diabetes moderado por Streptozotocin (100 mg/kg, via subcutânea). Aos 90 dias de vida, a confirmação do diabetes se deu pelo nível glicêmico entre 120-300 mg/dL (grupos diabéticos) e <120 mg/dL (grupos não-diabéticos) e, no dia 0 de prenhez, as ratas foram distribuídas entre os grupos não diabético sedentário (NDsed), não diabético exercitado (NDex), diabético sedentário (DSed) e diabético exercitado (Dex). O exercício aquático teve início no dia zero de prenhez e foi realizado até o dia 20 de prenhez (60 minutos/dia, 6 dias/semana). No 21º dia de prenhez, os animais foram eutanasiados e foi realizada a coleta de amostras de sangue, MRA, uretra e músculo sóleo. O MRA foi estudado por imunohistoquímica (fibras rápidas e lentas), imunofluorescência (células-satélite), expressão gênica (marcadores inflamatórios) e microscopia eletrônica de transmissão (mitocôndrias). As amostras de sangue foram utilizadas para quantificação de citocinas pró-inflamatórias, enquanto as amostras de sóleo foram utilizadas para determinação da atividade da enzima citrato sintase. A uretra foi estudada por Tricrômico de Masson para identificação de fibras colágenas e musculares, imunohistoquímica para marcação de fibras rápidas, fibras lentas e colágeno tipo I, e por Microscopia Eletrônica de Transmissão. As comparações múltiplas entre os grupos foi realizada pelo teste t-student e foi considerado limite de significância <0.05. O exercício aquático durante a prenhez aumentou número de células-satélite e a razão célula-satélite/fibra no grupo Dex, com diminuição do número de fibras rápidas e lentas. Além disso, o exercício aquático também aumentou o número e área de mitocôndrias no grupo Dex, e manteve a atividade da enzima citrato sintase no grupo Dex similar ao grupo NDsed, em contraste ao aumento observado no grupo Dsed. Não foi observada diferença entre os grupos na quantificação e expressão de TNF-α, IL-6 and IL-1β no MRA e no plasma. O papel da miogênese e da biogênese mitocondrial na melhora do perfil morfológico do MRA foi demonstrada pelo aumento das razões célula-satélite/fibra e mionúcleo/fibra, e aumento das razões número de mitocôndrias/fibra e área de mitocôndrias/fibra, além da relação positiva entre número de mitocôndrias e área da fibra. Em relação à uretra, o exercício aquático não alterou a histologia da uretra. Em contrapartida, ambos os grupos diabéticos apresentaram diminuição da área e número de fibras rápidas, e diminuição do número de fibras lentas. Em relação à deposição de colágeno, o exercício aquático manteve a área total de colágeno, colágeno em músculo estriado e colágeno em músculo liso similares entre os grupos Dex e NDsed, em contraste ao aumento evidenciado em Dsed. Em contrapartida, o exercício aquático aumentou a deposição de colágeno tipo I em Dex. A análise ultraestrutural mostrou ausência de rupturas de sarcômero no grupo Dex, diferentemente do grupo Dsed, enquanto linhas Z desorganizadas foram observadas nos grupos NDex, Dsed e Dex. Portanto, conclui-se que os principais mecanismos envolvidos na reversão da MiDG do MRA são a miogênese e biogênese mitocondrial, demonstrados pelo aumento do número de células-satélite, aumento de área e número de mitocôndrias, bem como o restabelecimento da atividade da citrato sintase. Em contrapartida, a prática de exercício aquático durante a prenhez de ratas diabéticas reverteu parcialmente a MiDG na uretra, demonstrada pela deposição de colágeno similar ao grupo não diabético e pela melhora no perfil ultraestrutural da uretra. Novos estudos com diferentes modalidades de exercício, assim como diferentes modalidades terapêuticas são necessários para entender a atenuação do dano causado pelo diabetes à uretra.

Gestational Diabetes Mellitus (GDM) is related with pregnancy-specific urinary incontinence (PS-UI). Diabetic-induced myopathy (DiM) was evidenced in the rectus abdominis muscle (RAM) in both human and animal models, and in the urethra in diabetic pregnant rats. In preclinical study, we have demonstrated the reversal of DiM by swimming exercise (SE) in mild hyperglycemic pregnant rats. However, the mechanisms involved in the reversal has not been reported. In addition, the study of swimming exercise (SE) as therapeutic strategy to DiM in the urethra is scarce. The aim of the present study is to expand the characterization of DiM in the RAM and investigate the role of myogenesis, mitochondrial biogenesis and inflammation in the reversal of the RAM DiM, and also investigate the effect of SE in the urethra DiM in pregnant rats. Mild hyperglycemic pregnant rats’ model was obtained by a unique subcutaneous injection of 100 mg/kg streptozotocin (diabetic group) on the first day of life in Wistar female newborns. At 90 days of life, after diabetes confirmation (glycemia 120-300 mg/dL in diabetic groups) the rats were mated and randomly allocated to remain sedentary or subjected to a SE protocol. The SE protocol started at gestational day 0 and consisted in of 60 min/day for 6 days/week in a period of 20 days in a swim tunnel. On day 21, rats were euthanized, and RAM, blood samples, urethra and the soleus muscle were collected. The RAM was studied by immunostaining (fast- and slow- fiber type and muscle stem cells content), real-time PCR (expression of pro-inflammatory markers) and transmission electron microscopy (mitochondria). Blood samples were used to quantification of plasma pro-inflammatory markers, while soleus muscle was used to determine citrate synthase activity. The urethra was studied by Masson’s Thrichrome to identification of muscle and collagen fibers, immunohistochemistry (fast and slow-twitch fibers and collagen type I staining) and by Transmission Electron Microscopy. Multiple comparison between groups was performed using Student t-test, and statistical significance was considered p<0.05. SE increased MuSCs number and MuSCs number/myonuclei number ratio in Dex group, with decreased fast and slow-twitch fibers number. Also, SE increased mitochondria area and diameter in Dex group, and returned citrate synthase activity to similar level as NDsed group, in contrast with the increase in Dsed group. No difference was found in the expression and quantification of TNF-α, IL-6 and IL-1β in both RAM and plasma. The role of myogenesis and mitochondria biogenesis in the RAM morphological improvements was demonstrated by the increase in MuSCs number/fiber ratio and myonuclei number/fiber ratio and increase in mitochondria number/fiber and mitochondria area/fiber, in addition to the positive relationship between mitochondria number and fiber area. Regarding the effect of SE on DiM in urethra, SE promoted no changes in urethra histology. However, Dex and Dsed groups had decreased fast-twitch fiber area and number and decreased slow-twitch fiber number. Also, Dex group showed similarity in total collagen area, collagen in striated muscle area and collagen in smooth muscle area compared with NDsed group, in contrast with the increase in Dsed group. However, SE increased collagen type I area in Dex group. Ultrastructural analysis showed absence of sarcomeres disruption area in Dex group, in contrast with the Dsed group, while disorganized Z lines were found in NDex, Dsed and Dex groups. Thus, we conclude that myogenesis and mitochondria biogenesis are the main mechanisms involved in the reversal of the RAM DiM by SE in pregnant rats, demonstrated by the increase in MuSCs number, increased mitochondria area and number and the restoration of citrate synthase activity. In urethra, SE reversed partially the DiM, demonstrated by the similar collagen deposition as non-diabetic condition and the improvement in the ultrastructural profile. Further studies with different types of exercise, as well as different therapeutic strategies are needed to the full comprehension of the attenuation of DiM in the urethra of diabetic pregnant rats.