Aspectos histopatológicos e aplicabilidade do cromógeno magenta na análise imuno-histoquímica de neoplasias melanocíticas cutâneas caninas

Abstract

Introdução: As neoplasias melanocíticas cutâneas são frequentes em cães. A análise histopatológica permanece como o método padrão-ouro para o diagnóstico destas lesões, enquanto a imuno-histoquímica é amplamente considerada uma ferramenta auxiliar. Contudo, a presença da melanina na maioria destas neoplasias dificulta a interpretação dos resultados imuno-histoquímicos principalmente de marcadores citoplasmáticos quando se utiliza o cromógeno 3,3’-Diaminobenzidina (DAB), pois tanto a melanina quanto a marcação positiva do DAB apresentam coloração marrom semelhante. Objetivos: Avaliar a aplicabilidade de um cromógeno de cor magenta na análise imuno-histoquímica de neoplasias melanocíticas cutâneas caninas pigmentadas e analisar a associação de diversos parâmetros histológicos e o diagnóstico morfológico. Metodologia: Trata-se de um estudo transversal e observacional caracterizado pela análise histopatológica e imuno-histoquímica de 40 neoplasias melanocíticas cutâneas caninas pigmentadas, previamente reavaliadas de forma independente por quatro avaliadores para determinação do diagnóstico. A avaliação da aplicabilidade do cromógeno magenta na análise imuno-histoquímica baseou-se na imunomarcação citoplasmática de um anticorpo consagrado para a análise destas lesões no cão, o anti-Melan-A (clone A103). Os parâmetros histopatológicos analisados incluíram contagem mitótica, espessura tumoral, ulceração, simetria, bordas do tumor, atipia nuclear, pigmentação, padrão da lesão, nível de Clark modificado, necrose intratumoral, morfologia celular predominante, infiltrado inflamatório linfoplasmocitário e invasão angiolinfática. Resultados: Vinte e três casos foram classificados como melanocitomas e dezessete casos como melanoma. Parâmetros histopatológicos como ulceração, atipia nuclear, pigmentação, nível de Clark modificado, simetria, bordas tumorais, morfologia celular predominante, necrose intratumoral e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário apresentaram uma associação estatisticamente significativa com o diagnóstico morfológico (p < 0.05). Também foi observada uma diferença estatisticamente significativa nas médias da contagem mitótica entre melanomas e melanocitomas (p < 0.05). Todos as amostras foram positivas para Melan-A. A maioria das neoplasias melanocíticas apresentou pigmentação em mais que 50% das células neoplásicas (18/40, 45%). Destas neoplasias intensamente pigmentadas, a maioria exibiu intensa marcação citoplasmática para Melan-A (13/18, 72.2%). O cromógeno magenta propiciou excelente contraste com a melanina e foi claramente visível nos tumores independentemente do nível de pigmentação. A imunomarcação foi facilmente identificada mesmo no citoplasma de células neoplásicas intensamente pigmentadas ou em neoplasias com abundantes melanófagos. Conclusão: A associação significativa de determinados parâmetros histopatológicos e o diagnóstico reforça a importância de sua análise criteriosa para uma conduta diagnóstica precisa, podendo esses critérios auxiliar na diferenciação entre neoplasias benignas e malignas. Os resultados deste estudo indicam que o cromógeno magenta é aplicável e eficaz na análise de tumores melanocíticos cutâneos caninos pigmentados, funcionando como uma alternativa viável ao DAB em protocolos convencionais de imuno-histoquímica. Além disso, estes achados abrem novas perspectivas para futuras pesquisas que explorem a aplicação deste cromógeno em outros marcadores de linhagem melanocítica, bem como em técnicas de dupla marcação.

Introduction: Cutaneous melanocytic neoplasms are common in dogs. Histopathological analysis remains the gold standard for diagnosing these lesions, while immunohistochemistry is widely considered an auxiliary tool. However, the presence of melanin in most of these tumors complicates the interpretation of immunohistochemical results, especially for cytoplasmic markers when using the chromogen 3,3′-Diaminobenzidine (DAB), as both melanin and DAB-positive staining exhibit a similar brown color. Objectives: To evaluate the applicability of a magenta-colored chromogen in the immunohistochemical analysis of pigmented canine cutaneous melanocytic neoplasms and to analyze the association between several histological parameters and diagnosis. Methodology: This is a cross-sectional and observational study characterized by the histopathological and immunohistochemical analysis of 40 pigmented canine cutaneous melanocytic neoplasms, which were independently re-evaluated by four assessors to determine the diagnosis. The applicability of the magenta chromogen in immunohistochemical analysis was based on cytoplasmic immunostaining of a well-established antibody for these lesions in dogs, the anti-Melan-A (clone A103). The histopathological parameters analyzed included mitotic count, tumor thickness, ulceration, symmetry, tumor margins, nuclear atypia, pigmentation, lesion pattern, modified Clark level, intratumoral necrosis, predominant cellular morphology, lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate, and angiolymphatic invasion. Results: Twenty-three cases were classified as melanocytomas and seventeen as melanomas. Histopathological parameters such as ulceration, nuclear atypia, pigmentation, modified Clark level, symmetry, tumor margins, predominant cellular morphology, intratumoral necrosis, and lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate showed statistically significant associations with morphological diagnosis (p < 0.05). A statistically significant difference in the mean mitotic counts was also observed between melanomas and melanocytomas (p < 0.05). All samples were positive for Melan-A. Most melanocytic neoplasms exhibited pigmentation in more than 50% of neoplastic cells (18/40, 45%). Among these highly pigmented neoplasms, the majority showed strong cytoplasmic immunostaining for Melan-A (13/18, 72.2%). The magenta chromogen provided excellent contrast with melanin and was clearly visible in tumors regardless of pigmentation level. Immunostaining was easily identified, even in the cytoplasm of intensely pigmented neoplastic cells or in neoplasms with abundant melanophages. Conclusion: The significant association of specific histopathological parameters with diagnosis underscores the importance of their careful analysis for reliable diagnostic conclusions. These criteria might aid in distinguishing between benign and malignant neoplasms. The results of this study indicate that the magenta chromogen is both applicable and effective in the analysis of pigmented canine cutaneous melanocytic tumors, serving as a viable alternative to DAB in conventional immunohistochemistry protocols. Furthermore, these findings open new perspectives for studying the application of this chromogen to other melanocytic lineage markers and its potential use in dual-labeling techniques.