Desenvolvimento de sistemas multifuncionais nanoestruturados para a liberação de fármacos administrados por via nasal no tratamento de glioblastoma

Abstract

Glioblastomas (GBM) representam 77% dos tumores malignos do sistema nervoso central (SNC) e ainda hoje, apesar de todos os avanços na terapia, continua com prognóstico limitado. A existência de barreiras fisiológicas como a barreira hematoencefálica (BHE) representa o principal obstáculo que impede que concentrações adequadas do fármaco atinjam o local de ação. Por suas vantagens anatômicas, uma estratégia proposta para a administração de fármacos destinados ao SNC consiste no uso da via nasal. Além disso, o uso de terapias combinadas utilizando fármacos capazes de agir em diferentes alvos moleculares deve ser considerada para o tratamento de doenças complexas como GBM. O candidato a fármaco ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (CHC) e o anticorpo monoclonal cetuximab (CTX) já são explorados devido à capacidade de agir em diferentes alvos moleculares nas células tumorais e aplicados em conjunto, como uma nova abordagem combinada, podem melhorar os resultados terapêuticos. De forma complementar, a utilização de sistemas de liberação baseados em nanotecnologia trará inevitavelmente ganhos terapêuticos à combinação proposta, permitindo que atributos específicos sejam agregados ao sistema e possibilite não somente a administração nasal, como também a associação de diferentes fármacos em um único carreador. Assim, o presente estudo propõe o desenvolvimento de diferentes plataformas poliméricas baseadas em poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) e quitosana trimetilada (TMC) ou quitosana oligomérica (OCS) para encapsulação do CHC. Ambos os sistemas desenvolvidos contendo CHC encapsulado exibiram tamanho de aproximadamente 300 a 400 nm contendo quitosana em sua superfície mais externa (potencial zeta positivo) e uma alta porcentagem de CHC encapsulado (± 85%). A caracterização físico-química dos sistemas mostrou sua estabilidade coloidal, principalmente na presença do fármaco CHC. Dados de DRX sugerem que a interação entre CHC e as nanopartículas (NPs) de PLGA/OCS apresentam padrões diferentes das NPs de PLGA/TMC. A conjugação entre CTX e NPs foi realizada através de ligações supramoleculares e covalente resultando em 85 e 58% de eficiência, respectivamente. A análise da eficácia terapêutica utilizando protocolos in vitro empregando linhas celulares de glioma U251 e SW1088, estabeleceu que, comparando ambos os sistemas conjugados, o PLGA/OCS parece ter uma capacidade terapêutica mais relevante. Por esse motivo, esse sistema foi selecionado para as futuras investigações. Análise de imunoblot confirmou que o CTX associado às NPs continua a exercer sua eficácia terapêutica. A análise da atividade antiangiogênica, desenvolvimento e progressão do tumor usando modelo de membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) revelaram uma tendência de redução do tumor quando NPs conjugadas foram utilizadas. Além disso, elas também exibiram uma atividade antiangiogênica. O perfil de liberação in vitro mostrou que a liberação de CHC foi sustentada eretardada pelo seu encapsulamento nas NPs. Estudos de permeação ex vivo utilizando mucosa nasal suína mostraram que a permeação de CHC foi modificada pela sua inclusão nos sistemas. A avaliação da capacidade de NPs administradas pela via nasal em atingir o SNC utilizando tomografia de fluorescência forneceu evidências de independentemente do procedimento de conjugação, NPs foram eficazes em realizar o transporte direto para o cérebro pela rota nasal. Portanto, considerando todos os resultados mencionados, o sistema desenvolvido exibiu um conjunto de atributos favoráveis que as tornam alternativas promissoras a serem futuramente consideradas no tratamento de GBM.

Glioblastomas (GBM) account for 77% of malignant tumors in the central nervous system (SNC), and today, despite all advances in therapy, remains with a limited prognosis. The existence of physiological barriers as the blood brain barrier (BBB) represents the main obstacle that limits appropriate concentrations of drugs designed to therapy. Due to their anatomical advantages, a strategy proposed for direct delivery to SNC involves the use of the nose-to-brain route. Besides, combination therapy that uses multiple drugs against different molecular targets should be considered for complex diseases such as GBM. Drugs like alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHC) and the monoclonal antibody cetuximab (CTX) are already explored for their capacity to act against different hallmarks of cancer and applied together, as a novel combining approach, might improve therapeutic outcomes. Therefore, advances in nanotechnology-based delivery systems will inevitably bring therapeutic gains to the proposed combination since they enable acquisition of important characteristics desired and also the association of different drugs into a single carrier. Thus, the current study proposes the development of different polymeric platforms based on poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and trimethyl chitosan (TMC) /chitosan oligosaccharide (OCS) for CHC encapsulation. Both CHC-loaded developed systems (PLGA/TMC and PLGA/OCS) exhibited nanostructure organization of about 300 to 400 nm, containing chitosan on their outermost surface (positive zeta potential) and a high percentage of CHC encapsulation (±85%). Physicochemical characteristics have shown great colloidal stability, especially in the presence of CHC drug. DRX data suggest that interaction between CHC and PLGA/OCS NPs follows patterns different than PLGA/TMC NPs. Conjugation between CTX and developed CHCloaded NPs was optimally obtained by supramolecular forces and covalent bonds, resulting in 85 and 58% of efficacy, respectively. Analysis of therapeutic efficacy using in vitro protocols employing U251 and SW1088 glioma cell lines, established that, comparing both conjugated systems, PLGA/OCS seems to have greatly therapeutic capacity. Therefore, this system was chosen to further investigations. Blot analysis confirmed that CTX associated with NPs continues to exert its therapeutic efficacy. Analysis of antiangiogenic activity, tumor development, and progression using the chicken chorioallantoic membrane disclosed a trend of tumor reduction when conjugated NPs were employed. In addition, this system also exhibited antiangiogenic activity. In vitro release profile showed that CHC release was sustained and retarded by drug encapsulation into NPs. The ex vivo permeation study applying nasal porcine mucosal showed that CHC permeation was delayed by the inclusion of system complexity. Analysis of NPs delivery using fluorescence tomography provides evidence that the developed PLGA/OCS NPs, independently of conjugation procedure,were effective in providing nose-to-brain transport. Taking into consideration all of the aforementioned results, we anticipate that the developed system exhibited a set of favorable attributes that make them promising alternatives to be further considered in GBM treatment.