Vesículas extracelulares e meio condicionado de células tronco mesenquimais e seu potencial imunomodulador em explantes endometriais bovinos

Abstract

O presente estudo teve como objetivo isolar, cultivar e caracterizar as células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) bovino, obtenção de vesículas extracelulares e meio condicionado do cultivo celular (MC) e avaliação do seu potencial imunomodulador em cultivo de explantes endometriais bovinos. Para isso, as CTM-TA foram coletadas (n=3) de tecido adiposo e sofreram isolamento, processamento e cultivo. As amostras foram submetidas à análise citogenética, imunofenotípica (CD44, CD29, vimentina, CD34 e MHCII), de viabilidade e de diferenciação (adipogênica, osteogênica e condrogênica), e então criopreservadas. Após descongelamento e expansão, o meio condicionado do cultivo celular foi submetido à ultracentrifugações para obtenção das vesículas extracelulares que foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e Western Blot (Alix e CD9). Explantes de endométrios bovinos (n=7) provenientes de abatedouro foram submetidos a cultivo e desafio com LPS (3μg/mL) por 48 horas. Os grupos experimentais foram CN (controle negativo, sem desafio com LPS), CP (controle positivo, apenas desafio com LPS), V (desafio com LPS e adição de vesículas extracelulares) e MC (desafio com LPS e adição de meio condicionado). Avaliou-se secreção de PGF2α e IL-1β por Elisa, morfologia do tecido através de histopatologia, expressão tecidual de Fas-L, TLR-4, PGDH e PGF2α-R por Imunoistoquímica. No cultivo celular das CTM-TA foi obtida uma população celular homogênea e fibroblastóide, com aderência ao plástico, expressando baixos níveis de CD34 e MHCII, e altos níveis de CD29, CD44 e vimentina. As células foram cromossomicamente estáveis, com boa viabilidade antes e após congelamento, e secretaram vesículas de aproximadamente 10 a 200nm de diâmetro, positivas para Alix e CD9 no Western Blot indicando a presença de exossomos (Exos) em uma população mista VEs. Não houve efeito de tratamento para secreção de PGF2α e IL-1β, nem na imunomarcação de TLR- 4, Fas-L, PGDH e PGF2α-R. Houve mudanças morfológicas como hipertrofia, atrofia e hiperplasia celular, bem como dilatação do lúmen glandular, independente do tratamento. Houve diminuição na densidade das glândulas após cultivo, devido à inflamação. Conclui-se que foi possível isolar, cultivar, caracterizar e criopreservar CTM-TA de bovinos, e estas células secretam VEs no meio condicionado de cultivo. Contudo, os achados apontam para inflamação no modelo in vitro de cultivo que se sobrepôs aos efeitos inflamatórios do desafio com LPS. Ademais, os tratamentos com V ou MC não resultaram em efeito imunomodulatório.