Relação genotípica e molecular de MICA e MICB em indivíduos saudáveis

Silva, Joyce Machado

Relação genotípica e molecular de MICA e MICB em indivíduos saudáveis

Arquivos

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Data

2024-02-27

Autores

Silva, Joyce Machado

Orientador

Castro, Camila Ferreira Bannwart

Coorientador

Castelli, Erick da Cruz

Pós-graduação

Biologia Geral e Aplicada - IBB 33004064080P3

Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Tipo

Dissertação de mestrado

Direito de acesso

Acesso restrito

Resumo

Resumo (português)

Os genes MICA e MICB pertencem ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano, considerada a região mais polimórfica do genoma. Codificam proteínas glicosiladas fixadas à membrana, que são semelhantes às moléculas de MHC-I, porém não se associam à β2-microglobulina nem apresentam antígenos. MICA e MICB são ligantes do receptor ativador NKG2D, expresso em células natural killer (NK) e linfócitos TCD8. Após essa interação, a resposta imune citolítica mediada por NKG2D será ativada contra células infectadas por vírus e células tumorais. No entanto, MICA/B podem ocorrer em duas isoformas: ancoradas à superfície celular ou como moléculas solúveis (sMICA/B) liberadas no citosol. A versão solúvel pode ocorrer devido a polimorfismos que impedem a tradução da porção transmembrana ou por ação de metaloproteinases. Enquanto a isoforma de membrana ativa a citotoxicidade celular de NK e TCD8+, o contrário ocorre para a isoforma solúvel. Diversos contextos clínicos apresentam MICA/ MICB como protagonistas na sua fisiopatologia, como rejeição de transplantes, doenças autoimunes, infecções por patógenos intracelulares, neoplasias malignas e até disfunções gestacionais. Considerando a dualidade da interação dessas moléculas com o sistema imune, o objetivo deste projeto foi avaliar o impacto de polimorfismos frequentes em MICA e MICB e sua funcionalidade molecular. Avaliamos a diversidade desses dois genes via sequenciamento de segunda geração e um pipeline de bioinformática específico para análise de genes do MHC humano. Selecionamos 19 amostras com genótipos de interesse (que codificam diferentes isoformas de MICA/B) para o cultivo de monócitos sem estímulo ou estimulado com LPS e peróxido de hidrogênio (H2O2) por 18 horas e armazenamento do sobrenadante para avaliação de sMICA/sMICB por ELISA de alta sensibilidade. A ancestralidade das amostras foi majoritariamente europeia. O alelo MICA*008:01, cujo polimorfismo induz a produção de MICA solúvel, foi, de fato, correlacionado com maior produção de sMICA em indivíduos homozigotos. No entanto, não houve diferença estatística na quantificação de MICA entre os sobrenadantes de cultura com e sem estímulos.Maiores níveis de sMICB têm sido associados ao alelo MICB*004:01, porém nenhuma significância estatística foi encontrada em plasma e sobrenadante celular entre grupos de indivíduos portadores desse alelo ou não. A relação entre a produção dessas proteínas solúveis plasmáticas e de sobrenadante celular com os alelos foi realizada pela primeira vez com amostras brasileiras. Uma vez que MICA e MICB são alvos de pesquisa em diversas condições clínicas, esses resultados podem contribuir diretamente para um melhor entendimento da funcionalidade dessas moléculas solúveis de maneira alelo-específica. Portanto, esses dados contribuirão para a ampliação do banco de dados desses genes, que poderão ser usados para aprimoramento de diagnósticos, rastreamento de doenças e imunoterapias.

Resumo (inglês)

The MICA and MICB genes belong to the major histocompatibility complex (MHC), human, considered the most polymorphic region of the genome. They encode glycosylated proteins fixed to the membrane, which are similar to MHC-I molecules, but do not associate with β2-microglobulin nor present antigens. MICA and MICB are ligands for the activating receptor NKG2D, expressed on natural killer (NK) cells and TCD8+ lymphocytes. Following this interaction, the NKG2D-mediated cytolytic immune response will be activated against virus-infected cells and tumor cells. However, MICA/B can occur in two isoforms: anchored to the cell surface or as soluble molecules released into the cytosol. The soluble version may occur due to polymorphisms that prevent the translation of the transmembrane portion or due to the action of metalloproteinases. While the membrane isoform activates the cellular cytotoxicity of NK and TCD8+, the opposite occurs for the soluble isoform. Several clinical contexts present MICA/MICB as protagonists in their pathophysiology, such as transplant rejection, autoimmune diseases, infections caused by intracellular pathogens, malignant cancer and even gestational dysfunctions. Considering the duality of the interaction of these molecules with the immune system, the objective of this project was to evaluate the impact of frequent polymorphisms in MICA and MICB and their molecular functionality. We assessed the diversity of these two genes via second-generation sequencing and a specific bioinformatics pipeline for analysis of human MHC genes. We selected 19 samples with genotypes of interest (encoding different isoforms of MICA/B) for culturing monocytes without stimulation or stimulated with LPS and hydrogen peroxide (H2O2) for 18 hours and storing the supernatant for evaluation of sMICA/ sMICB by high sensitivity ELISA. The ancestry of the samples was mostly European. The MICA*008:01 allele, whose polymorphism induces the production of soluble MICA, was, in fact, correlated with greater sMICA production in homozygous individuals. However, there was no difference statistically in the concentration of sMICA in culture supernatants with and without stimuli. Higher levels of sMICB have been associated with the MICB*004:01 allele, however no statistical significance was found in plasma and cell supernatant between groups of individuals carrying this allele or not. The relationship of these soluble plasma and cell supernatant proteins with the alleles of each one was carried out for the first time with Brazilian samples. Since MICA and MICB molecules are targets of research in several clinical conditions, these results can directly contribute to a better understanding of the functionality of these soluble molecules in an allele-specific manner. Therefore, these data will contribute to expanding the database of these genes, which can be used to improve diagnoses, disease tracking and immunotherapies.