Utilização de vesículas lipídicas unilamelares como carreadoras de antioxidantes em sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos

Abstract

As vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUVs) são consideradas ótimas ferramentas em sistemas de estudos que mimetizam membranas biológicas, devido à sua composição fosfolipídica e sensibilidade ao estresse oxidativo, além de possuírem capacidade de encapsular macromoléculas. Este foi o primeiro estudo a utilizar vesículas unilamelares gigantes como carreadoras de antioxidante (cisteina) em sistema de produção in vitro de embriões (PIVE). Sua utilização aliada ao sistema de cultivo é interessante, pois acredita-se poder ocorrer liberação do antioxidante de acordo com a demanda do sistema de PIVE. O objetivo desse estudo foi avaliar o comportamento das GUVs co-cultivadas in vitro com embriões bovinos, definir o método de indução ao estresse oxidativo e sua efetividade ao encapsular e carrear antioxidantes sob condições de estresse oxidativo. Foram testados indutores de estresse oxidativo [menadiona (MD) e peróxido de hidrogênio (H2O2)] nas GUVs, sendo o H2O2 em altas concentrações eficaz em induzir o estresse oxidativo através da alteração do diâmetro [Controle (18,96 μm) vs. H2O2 0,1 mM (17,71 μm), H2O2 0,5 mM (17,32 μm) e H2O2 1,0 mM (16,63 μm)]. Houve redução na taxa de desenvolvimento embrionário (P<0,05) dos grupos co-cultivados com GUVs e submetidos ao estresse oxidativo pela MD [Controle (26,70%) GUV (25,18%) vs. GUV+MD 5,0 μM (6,95%) e GUV+MD 7,5 μM (0,95%)]. As maiores concentrações intracelulares de ROS em embriões bovinos (P<0,05), foi no grupo GUV+MD 5,0 μM (16,28) vs. Controle (3,76) e GUV (3,99 ± 0,33). Ao co-cultivar GUVs, com cisteína encapsulada em seu interior, com embriões bovinos e submetê-los ao estresse oxidativo, pôde ser observado que a taxa de desenvolvimento embrionário foi menor (P<0,05) nos grupos (MD: 9,46%; MD + Cist: 1,19%; e GUV(Cist 3mM) + MD: 1,15%) e nos grupos cultivados com maior concentração de cisteina [GUV(Cist 129mM): 0,0% e GUV(Cist 129mM) + MD: 0,0%] em comparação aos demais grupos (controle: 25,58%; Cist: 31,77%; e GUV(Cist 3mM): 30,16. A taxa de desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto foi menor (P<0,05) nos grupos submetidos ao estresse oxidativo pela menadiona (MD: 9,46%; MD + Cist: 1,19%; e GUV(Cist 3mM) + MD: 1,15%) e nos grupos cultivados com maior concentração de cisteina [GUV(Cist 129mM): 0,0% e GUV(Cist 129mM) + MD: 0,0%] em comparação aos demais grupos (controle: 25,58%; Cist: 31,77%; e GUV(Cist 3mM): 30,16. O grupo GUV(Cist 3mM) exibiu menores (P<0,05) concentrações de ROS (0,09 UAF) comparado ao grupo Cist (0,16 UAF), mas ambos não diferiram do grupo controle (0,10 UAF), sendo as maiores concentrações de ROS observadas no grupo MD (0,34 UAF). Em conclusão as GUVs não promoveram efeito tóxico e nem aumentaram as concentrações intracelulares de ROS nos embriões. As GUVs produzidas com cisteína em seu interior apresentaram-se mais eficientes para prevenir o aumento de ROS.

Giant unilamellar lipid vesicles (GUVs) are considered to be great tools in study systems that mimic biological membranes due to their phospholipid composition and sensitivity to oxidative stress, as well as their ability to encapsulate macromolecules. This was the first study to use giant unilamellar vesicles as antioxidant (cysteine) carriers in an in vitro embryo production system (PIVE). Its use combined with the cultivation system would be interesting because it is believed that antioxidant release could occur according to the demand of the PIVE system. The aim of this study was to evaluate the behavior of GUVs co-cultured in vitro with bovine embryos, to standardize the oxidative stress induction method and its effectiveness to encapsulate and carry antioxidants under oxidative stress conditions. Oxidative stress inducers [meanadione (MD) and hydrogen peroxide (H2O2)] were tested in GUVs, and H2O2 at high concentrations was effective in inducing oxidative stress by changing the diameter [Control (18.96 μm) vs. 0.1 mM H2O2 (17.71 μm), 0.5 mM H2O2 (17.32 μm) and 1.0 mM H2O2 (16.63 μm)]. Embryonic development rate (P <0.05) was reduced in groups co-cultivated with GUVs and submitted to oxidative stress by DM [Control (26.70%) GUV (25.18%) vs. GUV + MD 5.0 μM (6.95%) and GUV + MD 7.5 μM (0.95%)]. The highest intracellular ROS concentrations in bovine embryos (P <0.05) were in the GUV + MD 5.0 μM group (16.28) vs. Control (3.76) and GUV (3.99 ± 0.33). By co-cultivating GUVs with encapsulated cysteine inside, with bovine embryos and subjecting them to oxidative stress, it could be observed that the embryonic development rate was lower (P <0.05) in the groups (MD: 9.46 % MD + Cist: 1.19%, and GUV (3mM Cist) + MD: 1.15%) and in the cultivated groups with the highest cysteine concentration [GUV (Cist 129mM): 0.0% and GUV (Cist 129mM ) + MD: 0.0%] compared to the other groups (control: 25.58%; Cyst: 31.77%; and GUV (Cist 3mM): 30.16. The embryonic development rate to the blastocyst stage was lower (P <0.05) in the groups subjected to oxidative stress by menadione (MD: 9.46%; MD + Cist: 1.19%; and GUV (Cist 3mM) + MD: 1.15%) and in cultivated groups with higher cysteine concentration [GUV (Cist 129mM): 0.0% and GUV (Cist 129mM) + MD: 0.0%] compared to the other groups (control: 25.58%; Cist: 31.77 % and GUV (Cist 3mM): 30.16.The GUV group (Cist 3mM) exhibited lower (P <0.05) ROS concentrations (0.09 UAF) compared to the Cist group (0, 16 UAF), but both did not differ from the control group (0.10 UAF), with the highest ROS concentrations observed in the MD group (0.34 UAF). In conclusion, GUVs did not promote toxic effects, nor did they increase intracellular ROS concentrations in embryos. GUVs produced with cysteine inside were more efficient to prevent the increase of ROS.