Padronização da produção de pó de veia safena magna descelularizada e liofilizada para uso em cultura celular
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Data
2024-04-30
Autores
Orientador
Bertanha, Matheus 
Coorientador
Pós-graduação
Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) - FMB 33004064079P5
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
Introdução: Na prática cirúrgica cardiovascular é bem estabelecido a realização de procedimentos cirúrgicos de pontes, enxertos ou bypass, para o tratamento da doença obstrutiva aterosclerótica. O ideal seria a substituição por um vaso sanguíneo com as mesmas características, o que não é possível na maior parte das vezes, utilizando como alternativa um fragmento da veia safena magna autóloga. Contudo, existem pacientes que se encontram na impossibilidade de autotransplante e, nestes casos, a engenharia de tecidos pode beneficiá-los através da produção de substitutos vasculares a partir de um arcabouço (scaffold) e células tronco autólogas. A produção de bioscaffolds têm evoluído, mas ainda apresenta gargalos no controle da nano e macroestrutura para a obtenção de arcabouços com características físico biológicas que mimetizam o tecido vascular. Objetivo: Produzir o pó da veia safena magna humana insuficiente descelularizada (VSMd) por liofilização, caracterizar quimicamente e testar o material em cultura celular, para uso do mesmo como biomaterial em engenharia de tecidos. Metodologia: As veias safenas magnas foram descelularizadas com o agente dodecil sulfato de sódio (SDS), em concentração de 2% por duas horas sob agitação. A qualidade do procedimento foi avaliada por análise histológica e de DNA residual. Para a obtenção do pó de VSMd foi realizada a técnica de liofilização, à vácuo e a frio, para então pulverizar o material obtendo-se um pó. A partir deste material foi realizada a quantificação de resíduo do agente descelularizante através do método de determinação do complexo SDS e azul de metileno em clorofórmio, que pode ser quantificada pela avaliação da densidade óptica. Foi realizada a descrição química do pó de VSMd através de estudo de proteômica, utilizando análise por cromatografia líquida de alta eficiência associada a espectrometria de massas. A fim de avaliar a citotoxicidade do pó de VSMd foi realizado dois ensaios colorimétricos, um utilizando o brometo tetrazólio (MTT) e o outro o corante vermelho neutro (NR). Foi realizado ainda uma avaliação do comportamento do pó da VSMd como facilitador de adesão celular e formação de culturas tridimensionais in vitro. Nos ensaios de cultura celular, o material foi avaliado em duas condições, diluído em ácido acético e diluído em meio de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM). Resultados: Foi obtido o pó de VSMd através da metodologia proposta e observou-se uma esterilização eficiente por UV. As análises de qualidade de descelularização por histologia e quantificação de DNA apresentação uma boa descelularização, contudo foi identificado uma concentração de SDS residual considerável na amostra. A partir dos testes de cultura celular observou-se uma boa proliferação das células VERO (células comerciais imortalizadas da linhagem derivado do rim do macaco verde africano, vervet), nas diluições de 15% e 12,5% para o pó de VSMd diluído em ácido acético, e nas diluições de 5% e 2,5% para o pó diluído em DMEM. Em ambos os experimentos as células se proliferaram sobre e em volta dos grânulos de VSMd. Conclusão: A partir do estudo realizado foi possível realizar a padronização da produção do pó de VSMd, foi identificado que a maior parte das proteínas da amostra possuem função estrutural e o material em cultura celular demonstrou que não é citotóxico para as células.
Resumo (inglês)
Introduction: In cardiovascular surgical practice it is well established to perform a surgical procedure of bridges, grafts, or bypass for the treatment of atherosclerotic obstructive disease. The ideal would be the replacement by a blood vessel with the same characteristics, however, this is not possible in most cases, using the autologous great saphenous vein as a substitute. There are still patients who see the impossibility of using autologous veins, in these cases, tissue engineering can benefit them, seeking to produce a vascular substitute from a scaffold and autologous stem cells. The production of biological vascular scaffolds has evolved, but it still presents bottlenecks in the control of the nano and macrostructure to obtain scaffolds with physical-chemical characteristics that mimic the vascular tissue. Objective: To produce powder from decellularized insufficient human great saphenous vein (VSMd) by lyophilization and chemically characterize it for use in biomaterials engineering. Methodology: The decellularization of the great saphenous veins was done with the agent sodium dodecyl sulfate (SDS) at 2% for two hours under agitation. The decellularization of the samples was evaluated by histological and residual DNA analysis. In order to obtain the VSMd powder, a freeze dryer was used that carry on a lyophilization by vacuum. From this material, the residue of the decellularizing agent was quantified using the method of determining the SDS complex and methylene blue in chloroform, which can be quantified by evaluating the optical density. The chemical description of the VSMd powder was carried out through a proteomic study, using high-performance liquid chromatography analysis associated with mass spectrometry. With a focus on evaluate the cytotoxicity of VSMd powder, two colorimetric tests were carried out,
one using tetrazolium bromide (MTT) and the other using neutral red dye (NR). An evaluation of the behavior of VSMd powder as a facilitator of cell adhesion and formation of 3D in vitro cultures. In cell culture assays, the material was evaluated under two conditions, diluted in acetic acid and diluted in Dulbecco’s modified Eagle’s culture medium (DMEM). Results: VSMd powder was obtained using the proposed methodology and efficient UV sterilization was observed. Analysis of decellularization quality by histology and DNA quantification showed good decellularization, however, a considerable residual SDS concentration was identified in the sample. From cell culture tests, good proliferation of VERO cells (immortalized commercial cells from the lineage derived from the kidney of the African green monkey, vervet) was observed in dilutions of 15% and 12.5% for the VSMd powder diluted in acetic acid, and in dilutions of 5% and 2.5% for the powder diluted in DMEM. In both experiments, cells proliferated on and around the VSMd granules. Conclusion: From the study carried out, it was possible to standardize the production of VSMd powder, it was identified that most of the proteins in the sample have a structural function and the material in cell culture demonstrated that it is not cytotoxic to cells.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português