Nanoemulsão para co-encapsulação de anfotericina B e micafungina: desenvolvimento, caracterização e avaliação do potencial terapêutico contra Candida auris

Abstract

Infecções sistêmicas causadas por Candida sp, principalmente as novas espécies como C. auris, têm aumentado nos últimos anos. Dos potenciais fármacos que podem ser empregados no tratamento, destacam-se a anfotericina B (AmB) e a micafungina (MICA); no entanto, a resistência antifúngica apresentada pelos microrganismos e os efeitos colaterais que os antifúngicos possuem limitam o seu uso na terapia. Desta forma, novas estratégias podem ser exploradas, como a incorporação destes fármacos em nanoemulsões (NE), com o objetivo de melhorar o perfil terapêutico. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antifúngico in vitro e in vivo da AmB e/ou da MICA incorporados em NE frente a Candida auris CDC B11903. As NEs foram compostas por 10% de óleo de girassol e colesterol (5:1) como fase oleosa, 10% de polioxietileno 20 cetil éter (Brij® 58) e fosfatodilcolina de soja (2:1) como tensoativo e 80 % de solução PBS como fase aquosa. As NE foram caracterizadas por ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS), potencial zeta, análise de rastreamento de partículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A estabilidade das nanoemulsões foi acompanhada por 100 dias em DLS. Foi validada uma metodologia analítica por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para quantificação de MICA e AmB e para os fármacos associados (MICAmB). Foi determinada a eficiência de encapsulação (EE) dos fármacos por HPLC e verificada a liberação in vitro das formulações. Posteriormente, realizou-se os ensaios biológicos in vitro utilizando a técnica de determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI90), Checkerboard, Time kill, ensaio de sorbitol e ergosterol e determinação do potencial anti-biofilme em diferentes tempos de formação. Foram realizados ensaios biológicos in vivo em modelo alternativo de Galleria mellonella para a determinação do potencial tóxico agudo e antifúngico e em camundongos com infecção sistêmica para a determinação da atividade antifúngica em tecidos. As NEs apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 41,2 nm a 48,6 nm, índice de polidispersão (PDI) de 0,259 a 0,429 e o Potencial Zeta (PZ) de -4,7 mV a -3,6 mV. A concentração de partículas variou de 6,87 x 1013 a 1,98 x 1014 partículas /mL. A metodologia analítica foi desenvolvida e validada com sucesso, apresentando resultados satisfatórios de seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de deteção e quantificação. A %EE para AmB, MICA em NE foram de 70 e 69 %, respectivamente e a EE de AmB e MICA em NEMA foi de 100 % e 44,7 %, respectivamente. A liberação dos fármacos incorporados nas NEs foi menor e mais lenta em comparação com o fármaco livre, variando de 62 a 100% de liberação após 24h de ensaio. Ensaios in vitro mostraram CMI90 mais baixo para fármacos livres. Houve sinergismo antimicrobiano entre MICA e AmB. Resultados promissores frente a biofilmes pré aderidos e formados foram observados após tratamento com os antifúngicos incorporados em NE, em especial frente aos biofilmes maduros. Ensaios de toxicidade aguda em larvas de G. mellonella mostraram que a NE diminuiu a toxicidade de AmB comparada com AmB livre. Os resultados de atividade antifúngica em modelo in vivo de G. mellonella mostraram que os fármacos incorporados em NE apresentaram melhor atividade terapêutica comparado aos fármacos livres. O ensaio em camundongos infectados evidenciou que as NEs potencializaram a ação antifúngica da AmB e MICAmB. Em conclusão, os resultados deste trabalham apontam o potencial das NE para incorporação de AmB e MICA no tratamento de infecções sistêmicas causada por C. auris.

Systemic infections caused by Candida sp, especially new species such as C. auris, have increased in recent years. Of the potential drugs that can be used in treatment, amphotericin B (AmB) and micafungin (MICA) stand out; however, the antifungal resistance presented by the microorganisms and the side effects that antifungals have limited their use in therapy. Therefore, new strategies can be explored, such as the incorporation of these drugs into nanoemulsions (NE), with the aim of improving the therapeutic profile. The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo antifungal potential of AmB and MICA incorporated into NE against Candida auris CDC B11903. The NEs were composed of 10% sunflower oil and cholesterol (5:1) as the oil phase, 10% polyoxyethylene 20 cetyl ether (Brij® 58) and soy phosphatidylcholine (2:1) as the surfactant and 80% PBS solution as the aqueous phase. The NE was characterized by light scattering (DLS), zeta potential, particle tracking analysis (NTA) and transmission electron microscopy (MET). The stability of the nanoemulsions was monitored for 100 days in DLS. An analytical methodology was validated by high-performance liquid chromatography (HPLC) for the quantification of MICA and AmB and for the associated drugs (MICAmB). The encapsulation efficiency (EE) of the drugs was determined by HPLC and the in vitro release of the formulations was verified. Subsequently, in vitro biological tests were carried out using the technique of determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC90), Checkerboard, Time kill, sorbitol and ergosterol assay and determination of the anti-biofilm potential at different formation times. In vivo biological tests were carried out on an alternative model of Galleria mellonella to determine the acute toxic and antifungal potential and on mice with systemic infection to determine the antifungal activity in tissues. The NEs had an average hydrodynamic diameter of 41.2 nm to 48.6 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.259 to 0.429 and a Zeta Potential (PZ) of -4.7 mV to -3.6 mV. The particle concentration ranged from 6.87 x 1013 particles /mL to 1.98 x 1014 particles /mL. The analytical methodology was successfully developed and validated, showing satisfactory results in terms of selectivity, linearity, precision, accuracy, limit of detection and quantification. The %EE for AmB, MICA in NE were 70 and 69 %, respectively, and the EE of AmB and MICA in NEMA were 100 % and 44.7 %, respectively. The release of the drugs incorporated into the NEs was lower and slower compared to the free drug, ranging from 62 to 100% release after 24 hours of testing. In vitro tests showed lower MIC90 for free drugs. There was antimicrobial synergism between MICA and AmB. Promising results against pre-adhered and formed biofilms were observed after treatment with the antifungals incorporated into NE, especially against mature biofilms. Acute toxicity tests on G. mellonella larvae showed that NE reduced the toxicity of AmB compared to free AmB. The results of antifungal activity in an in vivo model of G. mellonella showed that the drugs incorporated into NE had better therapeutic activity compared to the free drugs. The test on infected mice showed that NEs potentiated the antifungal action of AmB and MICAmB. In conclusion, the results of this study point to the potential of NEs for incorporating AmB and MICA in the treatment of systemic infections caused by C. auris.