Produção experimental de partículas virais infectantes do PCV2b a partir de genomas sintéticos
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Data
2024-06-27
Autores
Orientador
Araújo Júnior, João Pessoa 
Coorientador
Magro, Angelo José
Cruz, Taís Fukuta
Pós-graduação
Biotecnologia - IBB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
O Circovírus suíno (PCV) é prevalente na população mundial de suínos e é notável por ser o menor vírus conhecido em termos de genoma e estrutura. Além disso, possui a capacidade de replicação autônoma, o que o torna um modelo interessante para estudos in vitro. Entre as diferentes espécies desse vírus, o PCV2 se destaca por estar associado à Síndrome da Circovirose Suína (SCS), um conjunto de sinais clínicos que afetam vários órgãos, sendo a manifestação mais comum a perda dos índices zootécnicos, levando os animais infectados ao definhamento e a outras lesões. O PCV2 apresenta uma molécula alvo importante, a proteína Cap, que constitui seu capsídeo e está diretamente relacionada à resposta imunológica do hospedeiro. A espécie PCV2b circula com particular relevância no Brasil. O monitoramento e a prevenção dessa infecção, bem como a melhor compreensão de aspectos essenciais à estrutura viral, podem ajudar a evitar perdas econômicas significativas aos produtores e contribuir com o melhoramento do bem-estar animal. Com isso, este trabalho teve como objetivo principal a padronização e execução de procedimentos para induzir a replicação viral autônoma do PCV2b em cultura de células a partir de um genoma viral construído artificialmente com base em um genoma viral selvagem sequenciado. Assim, o genoma viral sintético foi transfectado em células de linhagem de testículo suíno (ST), esta cultura de células foi mantida sob condições ideais e submetida a passagens para acomodar o crescimento e a renovação celular. O DNA viral desta cultura de células foi quantificado por qPCR em intervalos de 24 horas. A produção da proteína do capsídeo foi analisada por ELISA. Um ensaio de infecção em cultivo celular foi realizado com o sobrenadante das células transfectadas e mantidas. O DNA viral foi detectado em todos os intervalos de coleta, tanto nas células submetidas aos ensaios de transfecção quanto nas de infecção. A quantificação da carga viral mostrou uma relação direta à confluência celular. A presença da proteína Cap foi confirmada por ELISA. A estrutura externa das partículas virais sintéticas foi visualizada a partir de microscopia eletrônica de transmissão com coloração negativa. Portanto, a produção experimental de partículas virais infectantes do PCV2b a partir de genomas sintéticos tem como vantagem a realização de estudos experimentais com mutações específicas. A padronização da produção de partículas virais sintéticas permite a obtenção de partículas virais a partir do genoma viral desenhado com quaisquer alterações de interesse. É possível explorar alterações baseadas em simulações computacionais, o que abre caminho para pesquisas futuras que explorarão aspectos essenciais da montagem e estabilidade do capsídeo desse vírus e pode, por exemplo, nortear o desenvolvimento de futuras vacinas ou outros produtos biotecnológicos.
Resumo (inglês)
Circovirus porcine (PCV) is prevalent in the global swine population and is notable for being the smallest known virus in terms of genome size and structure. Additionally, it has the ability to replicate autonomously, making it an interesting model for in vitro studies. Among the different species of this virus, PCV2 stands out for being associated with Circovirus Porcine Syndrome (SCS), a collection of clinical signs that affect various organs, with the most common manifestation being the loss of zootechnical performance, leading infected animals to wasting and other lesions. PCV2 has an important target molecule, the Cap protein, which constitutes its capsid and is directly related to the host’s immune response. The PCV2b species circulates with particular relevance in Brazil. Monitoring and preventing this infection, as well as better understanding key aspects of viral structure, can help avoid significant economic losses for producers and contribute to the improvement of animal welfare. Thus, the main objective of this study was to standardize and execute procedures to induce autonomous replication of PCV2b in cell culture using an artificially constructed viral genome based on a sequenced wild-type viral genome. The synthetic viral genome was transfected into porcine testis (ST) cell lines, and this cell culture was maintained under optimal conditions and passaged to accommodate cell growth and renewal. Viral DNA from this cell culture was quantified by qPCR at 24-hour intervals. Capsid protein production was analyzed by ELISA. A cell culture infection assay was performed using the supernatant from the transfected and maintained cells. Viral DNA was detected at all collection intervals, both in the cells subjected to transfection assays and in those used for infection assays. Viral load quantification showed a direct relationship with cell confluence. The presence of the Cap protein was confirmed by ELISA. The external structure of the synthetic viral particles was visualized using transmission electron microscopy with negative staining. Therefore, the experimental production of infectious PCV2b viral particles from synthetic genomes offers the advantage of performing experimental studies with specific mutations. Standardizing the production of synthetic viral particles allows for the generation of viral particles from a viral genome designed with any desired alterations. Alterations based on computational simulations can be explored, paving the way for future research that will explore key aspects of capsid assembly and stability in this virus, which could guide the development of future vaccines or other biotechnological products.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
VIEIRA, L. B. Produção experimental de partículas virais infectantes do PCV2b a partir de genomas sintéticos. Orientador(a): João Pessoa Araújo Júnior. Coorientador(a): Angelo José Magro. Coorientador(a): Taís Fukuta da Cruz. 2024. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu, 2024.