Do cerrado à mata atlântica, investigação de orbitídeos e ciclotídeos da biodiversidade brasileira

Abstract

O Brasil, com seu território vasto e diverso é reconhecido como um dos países mais importantes em biodiversidade do mundo, porém poucos peptídeos derivados de plantas têm sido estudados nos diferentes biomas. Nesta pesquisa é descrita a investigação de 8 espécies vegetais em busca de orbitídeos e ciclotídeos. Para a busca de orbítdeos presentes em espécies vegetais de biomas como Mata Atlântica e Cerrado, foram analisadas 5 espécies da família Euphorbiaceae, do gênero Croton (C. adamantinus, C. alchorneicarpus, C. fuscescens, C. lundianus e C. organensis) e 2 espécies da família Annonaceae, do gênero Annona (A. squamosa e A. cacans). Com o objetivo de encontrar ciclotídeos, a espécie escolhida para ser investigada foi Pombalia atropurpurea, da família Violaceae. Para o estudo químico destas espécies, os extratos obtidos de caules, folhas e sementes foram submetidos a uma pré-purificação em cartuchos com octadecilsilano, (C18), como fase estacionária, permitindo a obtenção das frações peptídicas. Essas frações foram analisadas por meio de LC-ESI-IT-MS confirmando a presença de peptídeos na faixa de massa de 500-1,0 kDa e 2,8-3,7 kDa para orbitídeos e ciclotídeos, respectivamente. Das espécies analisadas, apenas A. squamosa e A. cacans e P. atropurpurea apresentaram perfis com massas moleculares referentes a peptídeos cíclicos em suas frações. Dessa maneira, desenvolveu-se uma metodologia eficaz para a extração de orbitídeos presentes nas sementes das Annonas, utilizando etanol como solvente extrator. A análise das frações de P. atropurpurea permitiu a anotação de 30 potenciais ciclotídeos presentes nas folhas e no caule da espécie. Isolou-se, através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, cinco substâncias do caule (C40_P1-4 e C60_P1). O sequenciamento de aminoácidos dessa substância isolada C40_P1 foi realizado por digestão enzimática com endoproteinase Glu-C, tripsina e quimiotripsina, seguido por análise de MALDI-TOF/TOF-MS. Os espectros foram examinados e as sequências foram propostas, com base na presença das séries de íons b e y (fragmentos N e C-terminais). Foi possível caracterizar o composto C40_P1 como sendo CyO4. As atividades citotóxicas e larvicida foram avaliadas tanto para as frações enriquecidas em peptídeos quanto para os ciclotídeos isolados. Apenas as frações do caule apresentaram citotoxicidade frente as linhagens de carcinoma de colorretal humano (HCT116) com 91,36% de inibição frente a 33,31% de citotoxicidade das frações das folhas. Os isolados do caule foram testados e apresentaram citotoxicidade frente a HCT116 com 95,57% para CyO4, 95,14% para C40_P2, 91,66% para C40_P3, 94,95% para C40_P4 e 98,91% para C60_P1. As amostras são consideradas ativas quando a porcentagem de inibição das células de câncer for superior a 75%. Com relação a atividade larvicida, apenas as frações do caule apresentaram mortalidade acima de 50%, frente as larvas de Aedes aegypti, com 90% de mortalidade em 72 h. Os isolados também foram testados, os compostos C40_P2 e C60_P1 apresentaram uma boa atividade frente as larvas no período de 48 e 72 horas. O isolado CyO4 (38) apresentou atividade moderada nas primeiras 48 horas e os demais isolados apresentaram baixa atividade larvicida frente as larvas de A. aegypti.

Brazil, with its vast and diverse territory, is recognized as one of the world's most important countries in biodiversity. Still, few plant-derived peptides have been studied in the different biomes. This research describes the investigation of 8 plant species in search of orbitides and cyclotides. To search for orbitides present in plant species from biomes such as the Atlantic Forest and Cerrado, 5 species of the Euphorbiaceae family, of the Croton genus (C. adamantinus, C. alchorneicarpus, C. fuscescens, C. lundianus and C. organensis) and 2 species of the Annonaceae family, of the Annona genus (A. squamosa and A. cacans) were analyzed. Intending to find cyclotides, the species chosen to be investigated was Pombalia atropurpurea, of the Violaceae family. For the chemical study of these species, the extracts obtained from stems, leaves and seeds were subjected to pre-purification in cartridges with octadecylsilane (C18) as stationary phase, allowing the obtaining of peptide fractions. LC-ESI-IT-MS analyzed these fractions, confirming the presence of peptides in the mass range of 500-1.0 kDa and 2.8-3.7 kDa for orbitides and cyclotides, respectively. Of the species analyzed, only A. squamosa and A. cacans and P. atropurpurea presented profiles with molecular masses related to cyclic peptides in their fractions. Thus, an effective methodology was developed for extracting orbitides present in the seeds of Annonas, using ethanol as the extracting solvent. The analysis of the fractions of P. atropurpurea allowed the annotation of 30 potential cyclotides present in the leaves and stem of the species. Five compounds (C40_P1-4 and C60_P1) were isolated from the stem by high-performance liquid chromatography. Amino acid sequencing of the isolated compound C40_P1 was performed by enzymatic digestion with endoproteinase Glu-C, trypsin and chymotrypsin, followed by MALDI-TOF/TOF-MS analysis. The spectra were examined and the sequences were proposed based on the presence of the b and y ion series (N- and C-terminal fragments). The compound C40_P1 could be characterized as CyO4. The cytotoxic and larvicidal activities were evaluated for both the peptide-enriched fractions and the isolated cyclotides. Only the stem fractions showed cytotoxicity against human colorectal carcinoma cell lines (HCT116) with 91.36% inhibition compared to 33.31% cytotoxicity of the leaf fractions. The stem isolates were tested and showed cytotoxicity against HCT116 with 95.57% for CyO4, 95.14% for C40_P2, 91.66% for C40_P3, 94.95% for C40_P4 and 98.91% for C60_P1. The samples are considered active when the percentage of inhibition of cancer cells is greater than 75%. Regarding larvicidal activity, only the stem fractions showed mortality above 50%, against Aedes aegypti larvae, with 90% mortality in 72 h. The isolates were also tested, the compounds C40_P2 and C60_P1 showed good activity against larvae in the period of 48 and 72 hours. The isolate CyO4 (38) showed moderate activity in the first 48 hours and the other isolates showed low larvicidal activity against A. aegypti larvae.