Potencial biológico e quimiodiversidade dos fungos endofíticos Annulohypoxylon stygium e Annulohypoxylon yungensis de três espécies de algas marinhas vermelhas

Abstract

Nas últimas décadas, o ecossistema marinho tem se destacado como uma promissora fonte de novos produtos naturais devido à sua rica biodiversidade e potencial para novos organismos da fauna e flora marinhas. Dentro desse universo, os fungos endofíticos associados a organismos marinhos, incluindo algas, têm demonstrado grande potencial para fornecer novos metabólitos biologicamente ativos, com uma vasta quimiodiversidade. Ao serem privados de seu habitat natural, os microrganismos tendem a perder sua capacidade metabólica, um evento chamado silenciamento gênico, quando alguns genes responsáveis por determinadas vias biossintéticas deixam de ser expressos. Assim, o foco principal deste estudo foi explorar o potencial biológico e a quimiodiversidade de fungos endofíticos das espécies Annulohypoxylon stygium e Annulohypoxylon yungensis isolados da alga marinha vermelha Asparagopsis taxiformis. Para tanto, foram empregadas ferramentas que aumentam a diversidade química, como OSMAC, planejamento experimental e modulação epigenética. Inicialmente, foram construídas curvas de crescimento para ambos os fungos em meio líquido, permitindo determinar as melhores condições de crescimento em relação ao tempo de cultivo e produção de massa de extrato (A. stygium – 20 dias e A. yungensis – 30 dias) e, através de ferramentas de análise multivariada, compreender a dependência temporal da quimiodiversidade. A abordagem OSMAC, aliada a ferramentas quimiométricas de planejamento experimental, combinou os moduladores epigenéticos SAHA e procaína com variáveis físicas, como temperatura, agitação e fotoperíodo. Essa combinação foi empregada para otimizar o crescimento e a quimiodiversidade do fungo A. yungensis. Os extratos obtidos nos ensaios do planejamento experimental foram analisados por CLAE-EM/EM, e os dados espectrais foram analisados por GNPS, destacando as principais classes de metabólitos nesses extratos, como peptídeos, dicetopiperazinas e derivados de ácido 3,5- dihidroxidecanoico. A produção de extratos a partir do cultivo em fase sólida resultou na obtenção de uma substância inédita, o 2-metoxi-4-hidroxi-ε-caprolactona, e uma série de dicetopiperazinas (DKPs) do tipo 2,5-dicetopiperazina, cujas estruturas foram elucidadas utilizando métodos espectroscópicos e espectrométricos, incluindo RMN uni e bidimensionais, CLAE-DAD e CLUE-EM/EM. Aliando o cultivo em fase sólida e os moduladores epigenéticos (SAHA e procaína), a modulação promoveu a produção de várias substâncias, anotadas como peptídeos através da desreplicação com a ferramenta SIRIUS e análise por Rede Moleculares. Alguns desses peptídeos apresentaram atividade citotóxica contra células de câncer colorretal HCT116 e atividade bactericida contra linhagens resistentes de S. aureus. Além disso, o perfil metabólico de A. stygium isolado de diferentes espécies de algas marinhas, como A. taxiformis, Acanthophora spicifera e Bostrychia radicans, foi analisado por GNPS e ferramentas de análise multivariada, destacando a diversidade química e a influência da origem do hospedeiro no perfil metabólico do fungo. Os resultados deste trabalho contribuem para o entendimento da quimiodiversidade e do potencial biológico de fungos endofíticos marinhos, abrindo novas perspectivas para a bioprospecção de compostos bioativos.

In recent decades, the marine ecosystem has emerged as a promising source of new natural products due to its rich biodiversity and potential for novel marine fauna and flora organisms. Within this realm, endophytic fungi associated with marine organisms, including algae, have shown great potential to provide new biologically active metabolites, with vast chemodiversity. When deprived of their natural habitat, microorganisms tend to lose their metabolic capacity, an event known as gene silencing, where some genes responsible for certain biosynthetic pathways cease to be expressed. Thus, the main focus of this study was to explore the biological potential and chemodiversity of endophytic fungi from the species Annulohypoxylon stygium and Annulohypoxylon yungensis isolated from the red marine alga Asparagopsis taxiformis. To this end, tools that enhance chemical diversity, such as OSMAC, experimental design, and epigenetic modulation, were employed. Initially, growth curves were constructed for both fungi in liquid medium, allowing the determination of the best growth conditions concerning cultivation time and extract mass production (A. stygium – 20 days and A. yungensis – 30 days) and, through multivariate analysis tools, understanding the temporal dependence of chemodiversity. The OSMAC approach, combined with chemometric experimental design tools, integrated the epigenetic modulators SAHA and procaine with physical variables such as temperature, agitation, and photoperiod. This combination was employed to optimize the growth and chemodiversity of the fungus A. yungensis. The extracts obtained in the experimental design assays were analyzed by HPLC-MS/MS, and the spectral data were analyzed by GNPS, highlighting the main classes of metabolites in these extracts, such as peptides, diketopiperazines, and derivatives of 3,5-dihydroxydecanoic acid. The production of extracts from solid-phase cultivation resulted in the discovery of a novel substance, 2-methoxy-4-hydroxy-ε-caprolactone, and a series of 2,5-diketopiperazine-type diketopiperazines (DKPs), whose structures were elucidated using spectroscopic and spectrometric methods, including one- and two-dimensional NMR, HPLC-DAD, and UPLC-MS/MS. Combining solid-phase cultivation and epigenetic modulators (SAHA and procaine), the modulation promoted the production of several substances, annotated as peptides through dereplication with the SIRIUS tool and analysis by Molecular Networking. Some of these peptides exhibited cytotoxic activity against HCT116 colorectal cancer cells and bactericidal activity against resistant strains of S. aureus. Additionally, the metabolic profile of A. stygium isolated from different species of marine algae, such as A. taxiformis, Acanthophora spicifera, and Bostrychia radicans, was analyzed by GNPS and multivariate analysis tools, highlighting the chemical diversity and the influence of the host origin on the fungal metabolic profile. The results of this work contribute to the understanding of the chemodiversity and biological potential of marine endophytic fungi, opening new perspectives for the bioprospecting of bioactive compounds.