Substituição do uso de soro fetal bovino na manutenção do cultivo de células CER infectadas pelo vírus da doença infecciosa da bursa de Fabrícius

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Data

2009-02-26

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

Atualmente, as culturas celulares são consideradas uma das ferramentas mais importantes na virologia. Os meios de cultura utilizados na manutenção destes sistemas não oferecem capacidade às células de adsorver e se multiplicar em matrizes plásticas sem a adição suplementar de soro fetal bovino (SFB). Entretanto, o uso do SFB não é aconselhável devido às variações encontradas entre os lotes, o alto grau de proteína animal e a possibilidade da presença de agentes infecciosos. Além dos aspectos sanitários, existe o aspecto ético em relação à obtenção deste produto biológico. Com o aumento dos ensaios in vitro a quantidade estimada de produção de soro fetal bovino no mundo é de aproximadamente 500.000 litros/ano, isto significa, mais de 1.000.000 de fetos bovinos sacrificados para obtenção de SFB. O objetivo deste estudo foi cultivar as células CER (chicken embryo related) em diferentes meios de cultura: M-VSFM, 293- SFMII, VP-SFM, VP-SFM AGT, Glasgow, Leibovitz 15, adicionados de 2mg/ml ou 5mg/ml de IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) e verificar a possibilidade das estirpes virais Lukert e Farangher de se adaptarem neste sistema. Nesta cultura a expressão da fibronectina e da laminina (LB1 e LB2) foram dectadas por imunofluorescência e imunoperoxidase indireta, respectivamente. As monocamadas de células CER foram infectadas pela estirpe Lukert e Farangher, sendo a m.o.i (multiplicidade de infecção) utilizada de 1.0. Após três passagens, o RNA viral foi extraído para determinar as substituições genéticas. A região hipervariável do gene VP2 foi amplificada por RT/PCR. Para confirmar as mutações, os produtos da PCR foram seqüênciados e comparados com as seqüências de VDIB publicadas no GenBank. Os resultados demonstraram que o meio VP-SFM e 5µg/mL de IGF-1 aplicado às culturas foi o melhor para a adaptação direta do cultivo das monocamadas...
Currently, the cell culture are considered one of the tools most important in the virology. The culture medium used in the maintenance those systems do not offer capacity to the cells of attachment and if spread in plastic surfaces without the supplementary addition of foetal bovine serum (FBS). However, the use FBS is not advisable due to batch-tobatch variation in composition, the high animal protein content, and the possibility of the presence of infectious agents. Beyond the sanitary aspects, exists the ethical aspect in relation to the attainment of this biological product. With the increase of in vitro assays the amount of FBS produced in the world is estimated at approximately 500.000 litres/year, this carry in 1.000.000 bovine fetuses sacrified for FSB attainment. The aim of this study was to adapt the CER cells (chicken embryo related) on different medium: M-VSFM, 293-SFMII, VP-SFM, VP-SFM AGT, Glasgow, Leibovitz 15, supplemented by 2mg/ml or 5mg/ml IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) and to verify the possibility the Lukert and Farangher viral strain adapted in this system. The expression of the fibronectin and laminin (LB1 and LB2) were detected by immunofluorescence and indirect immunoperoxidase, respectively. The CER cells monolayer had been infected by Lukert and Farangher strain, being the m.o.i (infection multiplicity) used of 1.0. After three passages, viral RNA was isolated to determine the genetic changes. The hypervariable regions of the VP2 gene was amplified by RT/PCR. To confirm the genetic changes, PCR products were sequenced and compared to the sequences of the GenBank published VDIB strain.The results had demonstrated that the medium VP-SFM and 5µg/mL IGF-1 applied to the cultures was optimum for the direct adaptation of the culture of the monolayers without addition of FBS. In relation the detection of the extracellular protein, the fibronectin was induced... (Complete abstract click electronic access below)

Descrição

Palavras-chave

Celulas - Cultura e meios de cultura, Célula CER, IGF-1, Adaptação viral

Como citar

TAPPARO, Ane Franciele. Substituição do uso de soro fetal bovino na manutenção do cultivo de células CER infectadas pelo vírus da doença infecciosa da bursa de Fabrícius. 2009. 62 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, 2009.