Efeito do metotrexato veiculado por nanopartículas na ativação de inflamassomas na musculatura esquelética de ratos com infarto do miocárdio

Abstract

Introdução: Após o infarto do miocárdio, substâncias liberadas de cardiomiócitos necróticos sensibilizam receptores de ligação a nucleotídeos como NLRP1, NLRP3 e NLRC4. A ativação destes receptores estimula inflamassomas e o processo de inflamação aguda. Os inflamassomas ativam a caspase-1 e clivam a IL1B, induzindo a produção de mediadores inflamatórios. A inflamação inicial é benéfica para a reparação do tecido cardíaco; entretanto, se persistente, pode intensificar o processo de remodelação cardíaca e pode levar à insuficiência cardíaca. A insuficiência cardíaca cursa com alterações em diversos órgãos e sistemas como a musculatura esquelética. O comportamento dos inflamassomas na musculatura esquelética após o infarto agudo do miocárdio (IAM) não está esclarecido. O metotrexato (MTX) é um imunomodulador relacionado a redução do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares. O MTX associado a nanopartículas de núcleo lipídico (MTX-LDE) administrado 24 horas após a indução do IAM reduziu o processo inflamatório e melhorou a função cardíaca em ratos. Ainda não se sabe se o MTX pode influenciar a resposta imune à lesão do músculo esquelético associada à insuficiência cardíaca. Objetivo: Avaliar os efeitos da administração precoce e tardia de MTX-LDE na remodelação cardíaca e marcadores inflamatórios no músculo sóleo de ratos infartados. Métodos: Ratos Wistar machos submetidos a indução de infarto ou cirurgia fictícia foram separados nos grupos Sham (n=11), IAM (n=11), IAM-P (n=14) e IAM-T (n=12). No grupo IAM-P, o tratamento com MTX-LDE foi iniciado 24 horas após o IAM na dose de 1 mg/kg/semana via intraperitoneal e mantido por 10 semanas. No grupo IAM-T, o tratamento foi iniciado 3 semanas após a cirurgia e mantido por 7 semanas. Ecocardiograma foi realizado ao final do estudo; apenas ratos com área infartada do ventrículo esquerdo maior que 35% foram incluídos no estudo. A expressão de proteínas e genes de Nlrp1, Nlrp3, Nlrc4, proteína associada à apoptose com domínio CARD (Asc), Pro-Caspase-1, Caspase-1, Pro-Interleucina (Il)-1 beta, e Il1b foi quantificada por Western blotting e qPCR, respectivamente, no músculo sóleo. O trofismo do sóleo foi avaliado por morfometria. As comparações entre os grupos foram realizadas por análise de variância (ANOVA) complementada pelo teste de Bonferroni ou pelo teste de Kruskal-Wallis complementado por Dunn. Resultados: O tamanho do infarto não diferiu entre os grupos. O tratamento precoce ou tardio não alterou variáveis estruturais e funcionais do coração. A expressão proteica de Nlrp1 foi menor no grupo IAM-P que no Sham. Houve tendência (p=0,068) para a expressão proteica de Nlrc4 ser menor no grupo IAM-P que no Sham. O trofismo muscular e a expressão gênica e proteica de Nlrp3, Asc, Pro-Caspase-1, Caspase-1, Pro-Il1b e Il1b não diferiu entre os grupos. Conclusão: A administração precoce ou tardia de MTX-LDE não altera o processo de remodelação cardíaca pós-infarto em ratos. A administração precoce de MTX-LDE reduz o marcador de inflamação NLRP1 no músculo esquelético sóleo sem, no entanto, alterar o fenótipo muscular.

Introduction: After myocardial infarction, substances released from necrotic cardiomyocytes sensitize nucleotide-binding receptors such as NLRP1, NLRP3, and NLRC4. Activation of these receptors stimulates inflammasomes and acute inflammation. Inflammasomes activate caspase-1 and cleave IL1B, inducing the production of inflammatory mediators. Early inflammation is beneficial for cardiac tissue repair; however, if persistent, it may intensify the cardiac remodeling process and induce heart failure. Cardiac failure is associated with alterations in many organs and systems such as the skeletal muscle. The behavior of inflammasomes in skeletal muscle after acute myocardial infarction (AMI) is not clear. Methotrexate (MTX) is an immunomodulator which reduces the risk of developing cardiovascular diseases. MTX associated with lipid core nanoparticles (MTX-LDE) administered 24 hours after AMI induction decreased the inflammatory process and improved cardiac function in rats. Whether MTX modulates the immune response to heart failure-associated skeletal muscle changes is not known. Objective: To evaluate the effects of early or late administration of MTX-LDE on cardiac remodeling and inflammatory markers in the soleus muscle of infarcted rats. Methods: Male Wistar rats subjected to infarction induction or sham surgery were divided into Sham (n=11), AMI (n=11), AMI-E (n=14), and AMI-L (n=12) groups. MTX-LDE was initiated 24 hours after AMI induction at 1 mg/kg/week intraperitoneally and maintained for 10 weeks in the AMI-E group. MTX-LDE was initiated 3 weeks after surgery and maintained for 7 weeks in the AMI-L group. Echocardiogram was performed at the end of the study; only rats with infarcted area greater than 35% of total left ventricle area were included in the study. The expression of proteins and genes of Nlrp1, Nlrp3, Nlrc4, apoptosis-associated protein with CARD domain (Asc), Pro-Caspase-1, Caspase-1, Pro-Interleukin (Il)-1 beta, and Il1b was quantified by Western blotting and qPCR, respectively, in the soleus muscle. Soleus trophism was evaluated by morphometry. Comparisons between groups were made by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test or Kruskal-Wallis and Dunn. Results: Infarct size did not differ between groups. Early or late treatment did not change structural and functional variables of the heart. Protein expression of Nlrp1 was lower in the AMI-E group than in the Sham. There was a trend (p=0.068) for protein expression of Nlrc4 to be lower in the AMI-E group than in the Sham. Muscle trophism and gene and protein expression of Nlrp3, Asc, Pro-Caspase-1, Caspase-1, Pro-Il1b, and Il1b did not differ between groups. Conclusion: Early or late administration of MTX-LDE does not alter the post-infarction cardiac remodeling process in rats. Early administration of MTX-LDE reduces the inflammation marker NLRP1 in soleus skeletal muscle without changing muscle phenotype.