Identificação de novos RNAs não codificadores (ncRNAs) associados com a carcinogênese colorretal

Abstract

Os cânceres colorretais (CCRs) proximal e distal apresentam características moleculares e prognósticas diferentes. Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel relevante no câncer, sendo também associados com a carcinogênese colorretal. Novos miRNAs tecido-específicos e ainda não anotados foram relatados em diferentes tumores, indicando que novos mecanismos reguladores específicos de tecido podem contribuir para a carcinogênese. Assim, neste estudo investigamos a expressão de novos miRNAs em CCR, comparando CCR proximal e distal. Dados brutos de small-RNA-Seq foram obtidos de repositórios públicos e avaliados pela na plataforma mirMaster para identificação dos novos miRNAs. Dados de 522 CRC e 11 tecidos normais do TCGA (grupo de descoberta), e 35 CRC e 20 normais do GEO (GSE89974, grupo de validação) foram analisados. Especificidade tecidual foi avaliada comparando os novos miRs identificados nos tecidos normais de cólon com os miRs identificados pela plataforma miRMaster a partir de dados de small-RNAseq de 5 tecidos normais do TCGA: bexiga, fígado, cérebro, mama e pulmão. Genes alvos dos novos miRNAs foram identificados pela ferramenta miRDB e seus padrões de expressão foram avaliados pelo UCSC Xena Browser. Após sucessivas análises e filtragens identificamos 15 novos miRs candidatos expressos diferencialmente entre CRC e amostras normais, detectados em ambos os grupos de descoberta e validação. Caracterização molecular dos novos miRs mostrou similaridade com miRs conhecidos tais como, conteúdo de GC, tamanho, localização genômica em regiões contendo miRs conhecidos e em regiões de sítios frágeis cromossômicos. Quatro novos miRNAs se mostraram expressos diferencialmente entre CRC proximal e distal, sendo 3 novos miRNAs com níveis mais altos nos (miR-13844-5p, nov-miR-7154-5p e nov-miR-590-5p) e 1 (nov-miR-5035-3p) com níveis diminuídos nos tumores distais comparados aos proximais. Na análise de especificidade tecidual 2 novos miRs (nov-miR-3345-5p e nov-miR-13172-3p) foram identificados apenas nos tecidos colorretais. Níveis mais altos de nov-miR-3345-5p e nov-miR-7154-5p foram associados com menor sobrevida em pacientes com tumores do cólon direito e reto, respectivamente. Análise de predição de alvos dos 15 novos miRNAs revelou 2.412 genes. Análise de correlação dos pares miRNA-gene alvo identificou correlação negativa significativa entre 8 novos miRNAs (6 com expressão aumentada e 2 diminuídos) e 81 genes alvos. A seguir, 47 dos 81 genes foram identificados com algum tipo de interação gênica, sendo esses genes regulados por 7 miRNAs candidatos. Os genes CACNA1B e DLG2 mostraram o maior número de interações com outros genes sendo regulados pelo nov-miR-8861-5p e nov-miR-13172-3p, respectivamente. O nov-miR-8861-5p aparece como o miRNA regulando o maior número de genes (32 genes alvos) com interações entre si. Em resumo, identificamos 15 novos miRs expressos em tecidos de colorretal, sendo que três candidatos são expressos exclusivamente em tecidos colorretais. Além disso, a detecção da expressão diferencial de novos miRs e seus genes alvos entre tumores de cólon direito, cólon esquerdo e reto sugere alterações específicas de cada localização, que podem estar associadas com as diferenças clínicas e de progressão desses tumores. Esses resultados indicam a potencial relevância desses novos miRs para a biologia dos tumores colorretais do CCR e possíveis aplicações futuras como biomarcadores em CRC e alvos terapêuticos.

Proximal and distal colorectal cancer (CRCs) have different molecular and prognostic characteristics. MicroRNAs (miRNAs) play an important role in cancer and are associated with colorectal carcinogenesis. Novel tissue-specific miRNAs have been reported in different tumors, indicating that new tissue-specific regulatory mechanisms may contribute to carcinogenesis. Therefore, in this study, we investigated the expression of novel miRNAs in CRC by comparing proximal and distal CRC. Raw small-RNA-Seq data were obtained from public repositories and evaluated using the mirMaster platform to identify novel miRNAs in CRC tissues. Data from 522 CRC and 11 normal tissues from TCGA (discovery group) and 35 CRC and 20 normal tissues from GEO (GSE89974, validation group) were analyzed. Tissue specificity was evaluated by comparing the new miRs identified in normal colon tissues with the miRs identified by the miRMaster platform from small-RNAseq data from five normal tissues from TCGA: bladder, liver, brain, breast, and lung. Target genes of the novel miRNAs were detected using the miRDB tool and their expression patterns were evaluated using the UCSC Xena Browser. After successive analysis and filtering, we identified 15 new candidate miRNAs that were differentially expressed between CRC and normal samples, detected in both the discovery and validation groups. Molecular characterization of the novel miRs showed similarities with known miRs, such as GC content, size, and genomic location in regions containing known miRs and in regions of chromosomal fragile sites. Four new miRNAs were differentially expressed between proximal and distal CRC, with three presenting higher levels (miR-13844-5p, nov-miR-7154-5p, and nov-miR-590-5p) and one (nov- miR-5035-3p) decreased levels in distal tumors compared to proximal tumors. In the tissue specificity analysis, two novel miRNAs (nov-miR-3345-5p and nov-miR-13172-3p) were identified only in colorectal tissues. Higher levels of nov-miR-3345-5p and nov-miR-7154-5p were associated with shorter survival in patients with right-sided colon and rectal tumors, respectively. Target prediction of the 15 candidate miRNAs revealed 2,412 genes. Correlation analysis of the miRNA-target gene pairs showed a significant negative correlation between eight novel miRNAs (six upregulated and two downregulated) and 81 target genes. Next, 47/81 target genes regulated by seven novel miRNAs showed genetic interactions. CACNA1B and DLG2, regulated by nov-miR-8861-5p and nov-miR-13172-3p, respectively, showed the highest number of interactions with other genes. The nov-miR-8861-5p had the highest number of genes (32 target genes). In summary, we identified 15 novel miRNAs expressed in colorectal tissues, with three candidate miRNAs expressed exclusively in colorectal tissues. In addition, the detection of novel miRNAs and their target genes differentially expressed between right sided colon, left-sided colon, and rectal tumors suggests anatomic-specific changes that might be associated with the clinical and progression differences of these tumors. These results indicate the potential relevance of these novel miRNAs in colorectal tumor biology and their possible future applications as CRC biomarkers and therapeutic targets.