Determinantes estruturais da atividade necrótica e epidermolítica de toxinas esfoliativas produzidas por bactérias dos gêneros Mammaliicoccus e Staphylococcus
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Data
2024-04-29
Autores
Orientador
Arni, Raghuvir Krishnaswamy 
Coorientador
Mariutti, Ricardo Barros
Pós-graduação
Microbiologia - IBILCE 33004153074P9
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
Mammaliicoccus sciuri é uma bactéria comensal e patogênica de relevância clínica e veterinária. Recentemente uma cepa de M. sciuri foi descrita como agente etiológico da epidermite exsudativa (EE) em suínos e o principal fator de virulência envolvido nesta manifestação clínica foi a toxina esfoliativa C (ExhC). Essa enzima pertence ao grupo de toxinas esfoliativas (ETs), comumente descritas como glutamil endopeptidases semelhantes à quimotripsinas. No entanto, ao contrário da maioria dos membros desta família, as ETs são inativas contra uma ampla gama de substratos, apresentando alta especificidade à desmogleína1 (Dsg-1), uma proteína de adesão que é crucial para manter a integridade da pele. A clivagem da Dsg-1 causa esfoliação da epiderme de mamíferos e aumenta a eficiência da invasão e infecção do hospedeiro por bactérias patogênicas. Esta especificidade ao substrato sugere que, além da tríade catalítica H57-D102-S195, outras regiões desconhecidas da superfície das ETs e Dsgs-1 podem ser essenciais para desencadeamento da atividade epidermolítica. A ExhC tem importância adicional pois, além de causar EE em suínos e esfoliação de pele em camundongos, é capaz de induzir necrose em múltiplas linhagens celulares de mamíferos e de inibir a atividade fagocítica de macrófagos, propriedades não observadas para outras ETs. Experimentos anteriores indicaram que interações específicas com o fragmento ExhC44-92 são responsáveis pela atividade necrótica observada. A partir dessa observação, estudou-se a mutagênese sítiodirigida de resíduos específicos não conservados dentro deste domínio, possibilitando a construção de uma variante de ExhC com mutação em quatro resíduos (ExhCmut4) sem potencial necrótico, mas mantendo níveis de atividade enzimática similares da ExhC selvagem (ExhCwt). Ademais, a determinação das estruturas cristalinas de ExhCwt e ExhCmut4 garantiu a identificação da região associado à necrose. Apesar dos avanços na compreensão de como essa toxina atua, ainda não havia a descrição de inibidores para as múltiplas funções exercidas pela ExhC, assim como seus potenciais alvos moleculares durante os processos de necrose celular e inibição da atividade fagocítica de macrófagos. Para responder a essas questões, utilizamos a técnica de phage display e identificamos a Prenylcysteine oxidase-1-like protein de M. musculus como um potencial alvo da ExhC. A mesma técnica possibilitou a descoberta de peptídeos que atuam como inibidores e ativadores que modulam a atividade enzimática desta toxina. Os resultados obtidos tendo como alvo a ExhC, forneceram insights para investigações com à toxina esfoliativa E (ETE), a qual forma dímeros em solução. Essa informação, em conjunto com o fato de a ExhC ser encontrada como dímero na natureza, tornaram-se indicativos de que a homodimerização pode ser uma propriedade generalista entre as ETs, desempenhando papel funcional. No geral, os resultados aqui descritos representam avanços a respeito dos mecanismos de ação exercidos pela ExhC, contribuindo para uma compreensão mais profunda das ETs em um contexto amplo.
Resumo (inglês)
Mammaliicoccus sciuri is a commensal and pathogenic bacterium of clinical and veterinary relevance. Recently, a strain of M. sciuri was described as the etiologic agent of exudative epidermitis (EE) in pigs and the main virulence factor involved in this clinical manifestation was the exfoliative protein C (ExhC). This enzyme belongs to the group of exfoliative toxins (ETs), which are commonly described as glutamyl-endopeptidases belonging to the chymotrypsin family. However, unlike most members of this family, ETs are inactive against a wide range of substrates, showing high specificity for desmoglein-1 (Dsg-1), a cadherin-like adhesion protein that is crucial for maintaining skin integrity. Cleavage of Dsg-1 causes exfoliation of the mammalian epidermis and increases the efficiency of host invasion and infection by pathogenic bacteria. The previous substrate specificity suggests that, in addition to the H57-D102-S195 catalytic triad, other unknown regions on the surface of ETs and Dsgs-1
may be essential for triggering exfoliative activity. ExhC plays an important role because, in addition, to causing EE in pigs and skin exfoliation in mice, it is capable of inducing necrosis in multiple mammalian cell lines and of inhibiting the phagocytic activity of macrophages, properties not observed for other ETs. Previous experiments have indicated that specific interactions with the ExhC44-92 fragment are responsible for the necrotic activity. Based on this observation, site-directed mutagenesis of specific non-conserved residues within this fragment were studied, enabling the construction of an ExhC variant with a mutation in four residues
(ExhCmut4) lacking necrotic potential but retaining nearly wild-type (ExhCwt) levels of enzymatic activity. Moreover, the determination of the crystal structures of ExhCwt and ExhCmut4 enabled the identification of the necrosis-linked region. Despite some progress in understanding how this toxin acts, there has been no comprehensive description of inhibitors for the different functions carried out by ExhC, as well as its potential molecular targets involved in cell necrosis and the inhibition of macrophage phagocytic activity. To answer these questions, we used the phage display technique, and identified the Prenylcysteine oxidase-1-
like protein of M. musculus as a potential target of ExhC. The same technique enabled the discovery of peptides acting as inhibitors and activators that modulate the enzymatic activity of this toxin. The results obtained using ExhC as a target give insights for research into exfoliative toxin E (ETE), which forms dimers in solution. This information, together with the fact that ExhC is found as a dimer in nature gives an indication that homodimerization may be a general property among ETs, playing a functional role. Overall, the results outlined here mark a noteworthy advancement in uncovering the mechanisms of action of ExhC, contributing to a deeper understanding of ETs within a broader context.
Descrição
Palavras-chave
Toxina esfoliativa C , Toxina esfoliativa E , Mammaliicoccus sciuri , Staphylococcus aureus , Atividade necrótica , Atividade enzimática , Região associada à necrose , Phage display , Peptídeos , Inibidores , Potencializadores , Toxina esfoliativa E , Homodimerização , Exfoliative toxin C , Exfoliative toxin E , Necrotic activity , Enzymatic activity , Necrosis-linked region , Peptides , Inhibitors , Potentiators , Exfoliative toxin E , Homodimerization
Idioma
Português
Como citar
GISMENE, Carolina. Determinantes estruturais da atividade necrótica e epidermolítica de toxinas esfoliativas produzidas por bactérias dos gêneros Mammaliicoccus e Staphylococcus. (Doutorado em Microbiologia). 2024. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas (Ibilce), São José do Rio Preto, 2024.