Identificação molecular de micobactérias não tuberculosas e microbioma associado a doenças pulmonares

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Data

2023-12-08

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

As micobactérias não tuberculosas (MNT) são bacilos patogênicos amplamente distribuídos no meio ambiente e que são capazes de causar doenças de ordem crônica, progressiva e de disfunção imunológica, tanto em indivíduos saudáveis quanto em indivíduos imunocomprometidos, sendo associadas a morbidade e mortalidade. Aliado a isso, tem-se uma dificuldade em realizar o diagnóstico de MNT devido ao quadro clínico similar a outras doenças respiratórias. Com isso, é necessário estudar e desenvolver técnicas mais sensíveis e específicas que permitam a identificação molecular de MNT, levando ao diagnóstico e tratamento mais precisos e com impacto positivo na sobrevida dos pacientes. Logo, o projeto original envolveu a análise de amostras de escarro de pacientes com diagnóstico negativo para a tuberculose, confirmado pelo teste rápido molecular GeneXpert®, uma plataforma comercialmente disponível e padrão outro de diagnóstico da tuberculose. Foram realizados ensaios incluindo testes de iniciadores, PCR quantitativa e sequenciamento Sanger. Os resultados do sequenciamento passaram por análise de eletroferograma e posterior comparação com bancos de dados do genoma de micobactérias. Foram identificados gêneros de bactérias que são patógenos causadores de infecções respiratórias (Proteus, Neisseria, Haemophilus, Serratia, Staphylococcus e Veillonella). Também comparamos os resultados obtidos com os resultados das mesmas amostras que passaram pelo sequenciamento de nova geração (NGS), em que notamos a diversidade bacteriana entre as 30 amostras e entre os grupos analisados (MNT, positivos para TB, negativos para TB e traços) e obtivemos a abundância dos gêneros microbianos detectados pela metodologia de Sanger: Proteus e Neisseria (37%), Haemophilus (36,5%), Serratia (1,9%), Staphylococcus (75%), Veillonella e Neisseria (13,25%). Além disso, foi possível identificar o gênero Mycobacterium, mas sem a diferenciação entre MNT ou MTB. Neste trabalho, propomos realizar uma análise integrada e mais detalhada dos resultados de sequenciamento NGS, utilizando metodologias de bioinformática, a fim de identificar micobactérias não tuberculosas e outras bactérias que possam estar associadas à manifestação de doenças pulmonares.
Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are pathogenic bacilli widely distributed in the environment capable of causing chronic, progressive diseases and immune dysfunction in both healthy and immunocompromised individuals, leading to morbidity and mortality. Additionally, diagnosing NTM is challenging due to clinical similarities with other respiratory diseases. Therefore, it is essential to study and develop more sensitive and specific techniques enabling molecular identification of NTM, facilitating more precise diagnosis and treatment, ultimately positively impacting patient survival. The original project involved analyzing sputum samples from patients diagnosed negatively for tuberculosis, confirmed by the commercially available GeneXpert® molecular rapid test, a standard diagnostic platform for tuberculosis. Assays, including primer tests, quantitative PCR, and Sanger sequencing, were conducted. Sequencing results underwent electropherogram analysis and subsequent comparison with mycobacterial genome databases. Bacterial genera causing respiratory infections (Proteus, Neisseria, Haemophilus, Serratia, Staphylococcus, and Veillonella) were identified. Results were also compared with those obtained through next-generation sequencing (NGS), revealing bacterial diversity among the 30 samples and analyzed groups (NTM, TB-positive, TB-negative, and traces). The abundance of microbial genera detected by Sanger methodology was determined: Proteus and Neisseria (37%), Haemophilus (36.5%), Serratia (1.9%), Staphylococcus (75%), Veillonella and Neisseria (13.25%). Furthermore, the Mycobacterium genus was identified, but differentiation between NTM or MTB was not achieved. In this study, we propose a more integrated and detailed analysis of NGS sequencing results using bioinformatics methodologies to identify non-tuberculous mycobacteria and other bacteria associated with the manifestation of pulmonary diseases.

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Palavras-chave

MNT, Microbioma pulmonar, Sequenciamento de DNA, Testes moleculares

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