O efeito de Zerumbona sobre biofilme multiespécies formado sobre resina acrílica

Abstract

A cavidade oral é colonizada por fungos e bactérias que formam biofilmes polimicrobianos. Existe uma relação simbiótica entre Streptococcus mutans e Candida albicans que permite a formação de biofilmes mais robustos, tanto in vitro como in vivo. O uso de substâncias naturais para o controle de biofilmes é promissor, diante da resistência antimicrobiana a fármacos convencionais. O Zerumbona (ZER) demonstrou potencial na redução de componentes de biofilmes simples de C. albicans susceptível e resistente ao fluconazol. O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da ZER (256 e 512 ug/mL) no desenvolvimento e na erradicação de biofilmes mistos de C. albicans e S. mutans formados sobre discos de resina acrílica. A eficácia do tratamento foi avaliada por meio da contagem de colônias viáveis e análise dos componentes do biofilme [proteínas solúveis e insolúveis, polissacarídeos solúveis em água (WSP) e solúveis em álcali (ASP), peso total e peso seco insolúvel, DNA extracelular (eDNA)]. Discos de resina acrílica termicamente ativada foram fabricados e padronizados com rugosidade entre 2,7 e 3,7 µm (n=120). Para avaliar a eficácia da ZER na inibição da adesão e formação do biofilme, os discos foram imersos por 8 h nas soluções de ZER e, posteriormente, foi formado o biofilme de 48 h (n=60). Para avaliar a eficácia do ZER na erradicação do biofilme, os discos com biofilmes de 48 h, foram imersos por 20 min na solução (n=60). Como controle foram utilizadas as soluções de Clorexidina (CLX) e Nistatina (NYS). Os dados apresentaram distribuição normal e foram analisados pelo teste ANOVA one way, seguido do pós-teste de Tukey (dados homoscedásticos) e pós-teste de Games-Howell (heterocedásticos) (α=0,05). Os resultados comprovam a eficácia de ZER na redução de colônias viáveis de C. albicans e dos componentes do biofilme, em ambas condições avaliadas (ensaio de inibição de adesão e formação de biofilme e ensaio de erradicação dos biofilmes maduros). Os biofilmes formados sobre superfície previamente tratada com ZER 512 ug/mL apresentaram redução na viabilidade celular de C. albicans (5,07 log10) (p<0,001), mas o mesmo não pôde ser observado sobre S. mutans (p=1,000). Os biofilmes formados sobre a superfície tratada com ZER 512 ug/mL apresentaram redução nas proteínas insolúveis (37%) (p<0,001), WSP (13,75%) (p<0,001), ASP (46,96%) (p<0,001) e eDNA (11,47%) (p≤0,008). A viabilidade celular dos biofilmes maduros tratados com ZER 512 ug/mL também foi reduzida para C. albicans (1,49 log10) (p≤0,001), mas não foi possível observar atividade sobre S. mutans (p=1,000). Os componentes do biofilme foram consideravelmente reduzidos após o tratamento com ZER 512 ug/mL, com destaque para proteínas solúveis (20,35%) (p≤0,001), WSP (20,49%) (p<0,001), ASP (51,11%) (p<0,001) e eDNA (33,38%) (p<0,001). ZER reduziu a viabilidade celular de C. albicans em biofilmes mistos, bem como a biomassa e os componentes do biofilme, com destaque para proteínas (solúveis e insolúveis), polissacarídeos (ASP e WSP) e eDNA.

The oral cavity is colonized by fungi and bacteria that form polymicrobial biofilms. There is a symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans that allows the formation of more robust biofilms, both in vitro and in vivo. The use of natural substances to control biofilms is promising, given antimicrobial resistance to conventional drugs. Zerumbone (ZER) demonstrated potential in reducing simple biofilm components of C. albicans susceptible and resistant to fluconazole. The present study aimed to evaluate the influence of ZER (256 and 512 ug/mL) on the development and eradication of mixed biofilms of C. albicans and S. mutans formed on acrylic resin discs. Treatment efficacy was assessed by counting viable colonies and analyzing biofilm components [soluble and insoluble proteins, water-soluble (WSP) and alkali-soluble (ASP) polysaccharides, total weight and insoluble dry weight, extracellular DNA (eDNA)]. Thermally activated acrylic resin discs were manufactured and standardized with roughness between 2.7 and 3.7 µm (n=120). To evaluate the effectiveness of ZER in preventing biofilm formation, the discs were immersed for 8 h in ZER solutions and, subsequently, biofilm was formed for 48 h (n=60). Data presented a normal distribution and were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (homoscedastic data) and Games-Howell post hoc test (heteroscedastic data) (α=0.05). The results confirm the efficacy of ZER in reducing viable colonies of C. albicans and biofilm components under both evaluated conditions (adhesion inhibition and biofilm formation assay and mature biofilm eradication assay). Biofilms formed on surfaces pre-treated with ZER 512 µg/mL showed a reduction in the cellular viability of C. albicans (5.07 log10) (p<0.001), but this was not observed for S. mutans (p=1.000). Biofilms formed on surfaces treated with ZER 512 µg/mL exhibited a reduction in insoluble proteins (37%) (p<0.001), WSP (13.75%) (p<0.001), ASP (46.96%) (p<0.001), and eDNA (11.47%) (p≤0.008). The cellular viability of mature biofilms treated with ZER 512 µg/mL was also reduced for C. albicans (1.49 log10) (p≤0.001), but no activity was observed for S. mutans (p=1.000). Biofilm components were significantly reduced after treatment with ZER 512 µg/mL, notably soluble proteins (20.35%) (p≤0.001), WSP (20.49%) (p<0.001), ASP (51.11%) (p<0.001), and eDNA (33.38%) (p<0.001). ZER reduced the cellular viability of C. albicans in mixed biofilms, as well as the biomass and biofilm components, especially proteins (soluble and insoluble), polysaccharides (ASP and WSP), and eDNA.