Estudos moleculares e caracterização biofísica da hemoglobina de Amynthas gracilis (HbAg)

Abstract

Espécies de minhocas são comumente utilizadas em pesquisas de ecotoxicologia por possuírem características que auxiliam na identificação de poluentes no meio ambiente. Com o avanço da biologia molecular foi possível rastrear proteínas que podem ser utilizadas como marcadores de contaminação ambiental, é o caso da Hemoglobina extraída da espécie de Amynthas gracilis (HbAg). Conhecida como Hb extracelular gigante, a HbAg é um complexo proteico com massa molecular em torno de 3,6 MDa, com capacidade elevada de carreamento de moléculas de O2, estabilidade térmica e resistência ao estresse oxidativo. Todas essas propriedades fazem com que essas Hbs sejam alvo de pesquisas dentro da área de biotecnologia. O objetivo deste trabalho foi anotar o transcriptoma de A. gracilis, permitindo dessa forma, identificar sequências de proteínas com potencial biotecnológico, assim como as sequências codificadoras para a cadeias que compõem a HbAg. Além disso, foi realizado um estudo inicial de caracterização de uma das cadeias dessa hemoproteína, o monômero-d. A montagem do transcriptoma foi realizada utilizando estratégia de novo com o programa Trinity e a anotação funcional foi realizada com o programa OmicsBox que inclui a ferramenta do Blast2GO. As sequências das cadeias de HbAg foram identificadas através da análise de BLAST contra o banco de dados UniprotKB. O modelo para a unidade biológica HbAg foi construído por modelagem comparativa com auxílio do SWISS-model e os esquemas foram desenhados com o programa PyMOL. A caracterização inicial do monômero-d de HbAg foi feita através das técnicas de espectroscopia: absorção UV-Vis e fluorescência, além da técnica de espalhamento de luz (LSI) variando as condições experimentais em função do pH e interação com o surfactante SDS. Foram identificadas 260.616 ORFs das quais 187.866 sequências foram não redundantes e, a partir destas foram anotadas 92.939 sequências de proteínas. Proteínas com potencial biotecnológico assim como classes de enzimas envolvidas no processo de vermicompostagem foram identificadas. Todas as sequências das cadeias de HbAg foram preditas e partir delas construímos um modelo comparativo com base na estrutura de HbGp, Hb homóloga a HbAg. Todos os domínios proteicos mantiveram-se conservados em HbAg. Para o conjunto de dados do monômero-d em função do pH, notou-se auto-oxidação do grupo Heme em pH 9, aumento da intensidade de fluorescência em pH mais básico e possível auto agregação no pH mais ácido (5,0) e pH mais básico (9,0). Já para a interação com o SDS, notamos uma oxidação mais pronunciada a partir da concentração de 4 mmol L-1. O aumento gradativo da intensidade de fluorescência foi observado a partir da concentração de 1,2 mmol L-1 de surfactante. Os dados de LSI levantam a hipótese da formação de agregados entre o monômero-d e o surfactante assim como a presença de auto agregados de monômero em solução. Os dados apresentados neste trabalho trazem conhecimento básico acerca do potencial de A. gracilis no campo da biotecnologia e poderão fomentar pesquisas futuras nas áreas de genômica, com enfoque para o desenvolvimento e caracterização de biomarcadores moleculares na investigação de contaminação ambiental.

Earthworm species have been used in the field of ecotoxicology research due to their characteristics that support the identification of environmental pollution. Advances in molecular biology have made it possible to detect proteins with potential application of biomarkers, such as the Hemoglobin from Amynthas gracilis (HbAg). Known as an extracellular giant Hb, the HbAg is a protein complex with molecular mass of 3,6 MDa, high capacity of O2 carrier, thermal stability, and oxidative stress resistance. These properties lead to giant Hbs becoming a target of research in the biotechnological field. The objective of this study was to annotate the A. gracilis transcriptome, allowing the sequence identification of proteins with biotechnological potential, as well as the identification of chains that compound HbAg. Besides that, the initial biophysical characterization of monomer-d from HbAg was carried out. De novo transcriptome assembly was carried out using the Trinity program and the functional annotation was realized with OmicsBox program that includes the Blast2GO tool. The chain sequences of HbAg were identified through BLAST analysis against to UniprotKB database. The comparative model of HbAg biological unit was predicted using SWISS model and the schemes were drawn with the PyMOL program. The initial biophysical characterization of the monomer-d of HbAg was carried out using absorption spectroscopy: UV-Vis and fluorescence, in addition to the light scattering intensity technique, varying the experimental conditions as a function of pH and interaction with the surfactant SDS. In the transcriptome were identified 260,616 ORFs, of which 187,866 sequences were non- redundant. The OmicsBox program annotated 92,939 protein sequences. Proteins with biotechnological potential and enzymes involved in the vermicomposting process were identified. All sequences of the HbAg chains were predicted and the comparative model was constructed using HbGp structure as a template. The conservation of protein domains in HbAg model was preserved. The evaluation of the pH effect on monomer-d revealed the Heme oxidation in pH 9.0, the increase of fluorescence intensity in basic pH and the possible autoaggregation was observed in acid pH (5.0) and basic pH (9.0). The interaction of monomer-d and SDS showed a more pronounced Heme oxidation from the concentration of 4 mmol L-1 of the surfactant. The increase of fluorescence intensity was observed from 1.2 mmol L-1 of surfactant concentration. The LSI data support the hypothesis of aggregation between monomer-d and SDS, as well as, the presence of dimer of monomer-d in solution. The data presented in this work bring basic knowledge about the potential of A. gracilis in the field of biotechnology and may encourage future research in the area of genomics, focusing on the development and characterization of molecular biomarkers in the investigation of environmental contamination.