Detecção e caracterização molecular de Bartonella spp. em flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) das regiões Norte e Nordeste do Brasil

Abstract

A família Bartonellaceae é formada por -proteobactérias Gram-negativas intracelulares facultativas capazes de infectar diversos tipos celulares, principalmente eritrócitos e células endoteliais, de uma grande variedade de mamíferos. Algumas espécies são agentes causadores das bartoneloses, enfermidades emergentes e reemergentes com amplo espectro clínico e responsáveis por agravos à saúde humana e animal. A principal forma de transmissão destes agentes é por meio da picada ou excretas de artrópodes hematófagos (pulgas, piolhos, carrapatos e flebotomíneos), tornando a busca por vetores essencial. Flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) atuam como vetores de Bartonella baciliformis, agente causador da Doença de Carrión nos países andinos. Estão amplamente distribuídos pelo território brasileiro, com um total de 304 espécies diferentes identificadas. O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência e caracterizar molecularmente Bartonella spp. em flebotomíneos capturados nas regiões Norte e Nordeste do Brasil. Para tal, foram analisados 634 flebotomíneos, classificados em 44 espécies pertencentes a 14 gêneros diferentes, capturados nos estados do Acre (Rio Branco, n=206; Xapuri, n=106), Alagoas (Estação Ecológica de Murici, n=72), Bahia (Parque Nacional do Pau Brasil, n=91), Ceará (Parque Nacional do Ubajara, n=27), Pará (Floresta Nacional do Tapajós, n=51), Pernambuco (Parque Estadual de Dois Irmãos, n=14) e Roraima (Parque Nacional do Viruá, n=67). DNA foi extraído de cada espécime individualmente utilizando o TRIzolTM. Como resultado, 100% (634/634) das amostras de DNA foram positivas para o ensaio de PCR baseado no gene endógeno de invertebrados cox-1. Destas, 8,7% (55/634) foram positivas na PCR em tempo real quantitativa (qPCR) baseada na região intergênica 16S-23S (ITS) de Bartonella spp.: 48 amostras do Acre (n=18 Nyssomyia antunesi; n=sete Evandromyia walkeri; n=cinco Trichophoromyia sp.; n=quatro Lutzomyia sherlocki; n=três Nyssomyia shawi; n=dois Psychodopygus llanosmartinsi; n=dois Psychodopygus davisi; n=um Bichromomyia flaviscutellata; n=1 Evandromyia saulensis; n=1 Nyssomyia sp.; n=1 Nyssomyia whitmani; n=um Pintomyia nevesi; n=um Pintomyia serrana; n=um Viannamyia furcata); duas amostras de Alagoas (n=dois Trichophoromyia viannamartinsi); duas amostras de Roraima (n=um Psychodopygus squamiventris; n=um Psychodopygus ayrozai); uma amostra da Bahia (Trichopygomyia longispina); uma amostra do Ceará (Lutzomyia longipalpis); e uma amostra do Pará (Psychodopygus paraensis). Nos ensaios de PCR convencional utilizados para caracterização molecular, quatro (4/55; 7,3%) foram positivas para o gene gltA; quatro amostras (4/55; 7,3%) foram positivas para a região intergênica (ITS) 16-23S rRNA; duas (2/55; 3,6%) foram positivas para o gene ftsZ; duas (2/55; 3,6%) foram positivas para o gene pap31; uma (1/55; 1,8%) foi positiva para o gene rpoB; e uma (1/55; 1,8%) foi positiva para o gene nuoG. Dois amplicons puderam ser sequenciados, gerando uma sequência de 377 pb do gene gltA (detectada em espécime de Lutzomyia longipalpis capturado no Ceará) e uma sequência de 345 pb do gene nuoG (detectada em espécime de Nyssomyia antunesi capturado no Acre). A sequência nuoG demonstrou uma similaridade de aproximadamente 94% com sequências de Bartonella sp. previamente detectadas em morcegos da Guatemala. Já a sequência gltA demonstrou uma similaridade >96% com sequências de B. ancashensis previamente isoladas de humanos do Peru, além de posicionar-se filogeneticamente no mesmo sub-clado que tais sequências e uma sequência de Bartonella sp. previamente detectada em um flebotomíneo (Dampfomyia beltrani) do México. O presente estudo forneceu a primeira evidência molecular da ocorrência de Bartonella spp. em flebotomíneos do Brasil, em L. longipalpis do Ceará e N. antunesi do Acre.

The Bartonellaceae family is composed of Gram-negative, facultative intracellular α-proteobacteria capable of infecting various cell types, primarily erythrocytes and endothelial cells, in a wide range of mammals. Some species are the causative agents of bartonellosis, emerging and re-emerging diseases with a broad clinical spectrum, responsible for health issues for both humans and animals. The main route of transmission of these agents is through the bite or excreta of hematophagous arthropods (fleas, lice, ticks, and sand flies), making the search for vectors essential. Sand flies (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) act as vectors for Bartonella bacilliformis, the causative agent of Carrion's disease in Andean countries. They are widely distributed throughout Brazil, with a total of 304 different species identified. The present study aimed to investigate the occurrence and molecularly characterize Bartonella spp. in sand flies captured in the North and Northeast regions of Brazil. A total of 634 sand flies, classified into 44 species belonging to 14 different genera, were captured and analyzed from the states of Acre (Rio Branco, n=206; Xapuri, n=106), Alagoas (Murici Ecological Station, n=72), Bahia (Pau Brasil National Park, n=91), Ceará (Ubajara National Park, n=27), Pará (Tapajós National Forest, n=51), Pernambuco (Dois Irmãos State Park, n=14), and Roraima (Viruá National Park, n=67). DNA was extracted from each specimen individually using TRIzolTM. As a result, 100% (634/634) of the DNA samples were positive in the PCR assay based on the endogenous invertebrate gene cox-1. Of these, 8.7% (55/634) were positive in the quantitative real-time PCR (qPCR) based on the 16S-23S intergenic region (ITS) of Bartonella spp.: 48 samples from Acre (n=18 Nyssomyia antunesi; n=seven Evandromyia walkeri; n=five Trichophoromyia sp.; n=four Lutzomyia sherlocki; n=three Nyssomyia shawi; n=two Psychodopygus llanosmartinsi; n=two Psychodopygus davisi; n=one Bichromomyia flaviscutellata; n=one Evandromyia saulensis; n=one Nyssomyia sp.; n=one Nyssomyia whitmani; n=one Pintomyia nevesi; n=one Pintomyia serrana; n=one Viannamyia furcata); two samples from Alagoas (n=two Trichophoromyia viannamartinsi); two samples from Roraima (n=one Psychodopygus squamiventris; n=one Psychodopygus ayrozai); one sample from Bahia (Trichophoromyia longispina); one sample from Ceará (Lutzomyia longipalpis); and one sample from Pará (Psychodopygus paraensis). In the conventional PCR assays used for molecular characterization, four (4/55; 7.3%) were positive for the gltA gene; four samples (4/55; 7.3%) were positive for the 16-23S rRNA intergenic region (ITS); two (2/55; 3.6%) were positive for the ftsZ gene; two (2/55; 3.6%) were positive for the pap31 gene; one (1/55; 1.8%) was positive for the rpoB gene; and one (1/55; 1.8%) was positive for the nuoG gene. Two quality sequences were obtained: a 377 bp sequence of the gltA gene (detected in a Lutzomyia longipalpis specimen captured in Ceará) and a 345 bp sequence of the nuoG gene (detected in a Nyssomyia antunesi specimen captured in Acre). The nuoG sequence showed approximately 94% similarity with Bartonella sp. sequences previously detected in bats from Guatemala. The gltA sequence showed >96% similarity with B. ancashensis sequences previously isolated from humans in Peru, as well as phylogenetically positioned in the same sub-clade as these sequences and a Bartonella sp. sequence previously detected in a sandfly (Dampfomyia beltrani) from Mexico. This study provided the first molecular evidence of the occurrence of Bartonella spp. in sand flies from Brazil, in L. longipalpis from Ceará and N. antunesi from Acre.