Caracterização bioquímica e purificação das endoglucanases produzidas por Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo em estado sólido

Massarente, Vanessa Salto

Caracterização bioquímica e purificação das endoglucanases produzidas por Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo em estado sólido

Arquivos

massarente_vs_me_sjrp_int.pdf (1.2 MB)

Data

2018-04-24

Autores

Massarente, Vanessa Salto

Orientador

Bonilla Rodriguez, Gustavo Orlando

Gomes, Eleni

Pós-graduação

Microbiologia - IBILCE

Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Tipo

Dissertação de mestrado

Direito de acesso

Acesso aberto

Resumo

Resumo (português)

As celulases são enzimas empregadas principalmente na indústria de papel e celulose e têxtil, e têm ganhado destaque pelo seu potencial hidrolítico em materiais lignocelulósicos na produção de etanol, já que são capazes de hidrolisar a celulose. O objetivo do projeto foi efetuar a caracterização e isolamento das endoglucanases produzidas pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo em estado sólido. Foram realizados ensaios para avaliar os efeitos do pH, da temperatura, de diversas substâncias químicas, cátions e compostos fenólicos na atividade enzimática. A estimativa da massa molecular foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e como resultado foi possível observar sete endoglucanases detectadas por zimografia, que possuem massa molecular estimada entre 26 e 82 kDa. O valor ótimo para o pH do extrato enzimático bruto foi 5,5 e 70ºC para a temperatura ótima em incubação de 4 minutos. Em relação à estabilidade do extrato bruto, os maiores valores ocorreram entre as faixas de pH de 6 a 6,5, e 30 e 40ºC para temperatura até 120 minutos. Entre os reagentes testados, Triton, DTT e Isopropanol aumentaram a atividade enzimática sobre o extrato bruto em cerca de 10%. Os cátions NaCl, SrCl2, BaCl2 e ZnCl2 aumentaram a atividade das endoglucanases. Em relação aos compostos fenólicos, todos induziram em diversos graus o decréscimo da atividade das endoglucanases do extrato bruto. Das sete endoglucanases, três foram isoladas pela extração direta do gel após eletroforese em poliacrilamida. Duas possuem atividade considerável entre os pHs 4,0 e 7,0, e uma em pH 10,5. As três enzimas apresentaram redução em sua atividade nos pHs 8,5 e 9,0, porém apresentaram boa atividade nos pHs 10,0 e 10,5 e tiveram sua temperatura ótima em 70ºC. Avaliaram-se os parâmetros termodinâmicos das endoglucanases do extrato enzimático bruto, permitindo determinar o tempo de meia vida em 165 minutos a 50ºC, e elevada resistência estrutural à desnaturação térmica, analisados pela variação da entropia, energia livre de Gibbs e entalpia.

Resumo (inglês)

Cellulases are enzymes used mainly in the paper and cellulose and textile industries and have been highlighted for their hydrolytic potential in lignocellulosic materials in the production of ethanol, since they are capable of hydrolyzing cellulose. The objective of the project was to characterize and isolate the endoglucanases produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 in solid state cultivation. Tests were carried out to evaluate the effects of pH, temperature, several chemical substances, cations and phenolic compounds on enzymatic activity. The molecular weight estimation was performed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and as a result it was possible to observe seven endoglucanases detected by zymography, which have an estimated molecular mass between 26 and 82 kDa. The optimum pH for the crude enzyme extract was 5.5, and 70 °C for the optimum incubation temperature for 4 minutes. Regarding the stability of the crude extract, the highest values occurred between the pH ranges from 6 to 6.5, and 30 to 40ºC for temperature up to 120 minutes. Among the tested reagents, Triton, DTT and Isopropanol increased the enzymatic activity on the crude extract by about 10%. NaCl, SrCl2, BaCl2 and ZnCl2 increased the endoglucanase activity. With respect to the phenolic compounds, all induced to varying degrees the decrease in the activity of the endoglucanases of the crude extract. Of the seven endoglucanases, three were isolated by direct gel extraction after polyacrylamide electrophoresis. Two have considerable activity between pHs 4.0 and 7.0, and one at pH 10.5. The three enzymes presented a reduction in their activity at pHs 8,5 and 9,0, but they showed good activity at pHs 10.0 and 10.5 and had their optimum temperature at 70ºC. The thermodynamic parameters of the endoglucanases of the crude enzymatic extract were determined, allowing the determination of the half-life as 165 minutes at 50ºC, and high structural resistance to thermal denaturation, analyzed by the entropy, Gibbs free energy and enthalpy variation.