Análise Histopatológica de glândulas submandibulares de camundongos K18-hACE2 infectados por SARS-CoV-2

Abstract

Em dezembro de 2019, foi identificado o primeiro caso do novo coronavírus SARSCoV-2 em Wuhan, que se espalhou pelo mundo causando uma doença potencialmente fatal denominada COVID-19. A saliva é um importante meio de transmissão do SARS-CoV-2, pois as glândulas salivares são rotas para infecção, replicação e transmissão viral devido a presença da enzima conversora de angiotensia-2 (ACE2), bem como da enzima serina protease transmembrana II (TMPRSS2) em células da glândula submandibular de pacientes infectados. Os camundongos transgênicos k18-hACE2 são bons modelos para estudo da COVID- 19,pois expressam a ACE2 humana (hACE2) causando a infecção. As citocinas pró-inflamatórias apresentam papel fundamental na resposta sistêmica causada pela COVID-19 culminando numa hipercitocinemia. Neste estudo, foi proposto avaliar a imunolocalização da enzima hACE2 e da proteína spike viral nas glândulas submandibulares de camundongos k18-hACE2 infectados com SARS-CoV-2. Foi avaliada a participação das citocinas inflamatórias IL1-β e TNF-α bem como o impacto da infecção na integridade estrutural do tecido glandular e na imunoexpressão do fator de crescimento epidermal (EGF). Foram utilizados 10 camundongos k18-hACE2 adultos distribuídos em dois grupos: 5 dias (G5D) e controle (GC). Os animais do G5Dforam inoculados com 5x104 PFU (em 40 µL) por via intranasal. Os animais do GC foram inoculados com igual volume de meio de cultura DMEM. Após 5 dias de infecção, as glândulas foram fixadas e processadas para inclusão em parafina. Fragmentos glandulares foram processados para análise ao microscópio eletrônico de transmissão (MET). Nos cortes corados com H.E., foi avaliada a densidade de volume(Vv) de ácinos e dos Túbulos Convolutos Granulares (TCG) e o diâmetro dos TCG. Areação de PAS foi realizada para detecção da área de secreção PAS positiva. Foram realizadas reações de imunofluorescência para detecção de hACE2, spike viral, actina, TNF-α, IL1-β e EGF e método de TUNEL para identificação de morte celular. As áreas imunofluorescentes de actina, TNF-α, IL1-β e EGF foram mensuradas e os resultados foram submetidos a análise estatística utilizando-se o Student-test (p≤0,05). Nos G5D encontrou-se imunomarcação positiva para hACE2 e spike viral. Na MET foram observadas células mioepiteliais contendo vesículas de dupla membrana repletas de partículas virais, confirmando a infecção. As análises morfométricas mostraram redução significante da Vv dos TCG e aumento de Vv de ácinos, bem como diminuição do diâmetro dos TCG e aumento da secreção PAS positiva nos TCG nos animais do G5D. A infecção viral desencadeou severas alterações na histoarquitetura do tecido glandular. Essas alterações foram associadas à alta incidência de morte celular, confirmada pelo método do TUNEL e pelas características apoptóticas observadas ao MET. No G5D, as citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β aumentaram em resposta à entrada e replicação viral. A redução significante de actina, associada à presença de célula mioepitelial com característica apoptótica indica que essa célula é susceptível à infecção viral e morre por apoptose. A imunoexpressão de EGF nos TCG foi significantemente maior no G5D sendo uma possível tentativa de reparo do tecido glandular frente a infecção viral.

In December 2019, the first case of the new SARS-CoV-2 coronavirus was identified in Wuhan, which has spread around the world causing a potentially fatal disease calledCOVID-19. Saliva is an important means of transmission of SARS-CoV-2, as salivary glands are routes for infection, replication and viral transmission due to the presence of angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2), as well as transmembrane serine protease enzyme II (TMPRSS2) in submandibular gland cells of infected patients. Thek18-hACE2 transgenic mice are good models for studying COVID-19, as they expressthe human ACE2 (hACE2) causing the infection. Pro-inflammatory cytokines play a fundamental role in the systemic response caused by COVID-19, culminating in hypercytokinemia. In this study, it was proposed to evaluate the immunolocalization of the hACE2 enzyme and the viral spike protein in the submandibular glands of k18- hACE2 mice infected with SARS-CoV-2. The participation of the inflammatory cytokines IL1-β and TNF-α was evaluated, as well as the impact of the infection on the structural integrity of the glandular tissue and on the immunoexpression of epidermal growth factor (EGF). Ten adult k18-hACE2 mice were used, divided into two groups: 5days (G5D) and control (GC). The G5D animals were inoculated with 5x104 PFU (in 40 µL) intranasally. The CG animals were inoculated with the same volume of DMEM culture medium. After 5 days of infection, the glands were fixed and processed for paraffin embedding. Gland fragments were processed for analysis under a transmission electron microscope (TEM). In the sections stained with H.E., the volume density (Vv) of the acini and Granular Convoluted Tubules (GCT) and the diameter ofthe GCT were evaluated. The PAS reaction was performed to detect the area of PAS- positive secretion. Immunofluorescence reactions were performed to detect hACE2, viral spike, actin, TNF-α, IL1-β and EGF and the TUNEL method to identify cell death. The immunofluorescent areas of actin, TNF-α, IL1-β and EGF were measured and the results were subjected to statistical analysis using the Student-test (p≤0.05). G5D mice showed positive immunolabeling for hACE2 and viral spike. Myoepithelial cells containing double membrane vesicles filled with viral particles were observed in the MET, confirming infection. Morphometric analyses showed a significant reduction in the VV of the GCTs and an increase in the VV of the acini, as well as a reduction in the diameter of the GCTs and an increase in PAS-positive secretion in the GCTs in the G5D animals. The viral infection triggered severe changes in the histoarchitecture of the glandular tissue. These changes were associated with a high incidence of cell death, confirmed by the TUNEL method and the apoptotic characteristics observed by MET. In G5D, the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β increased in responseto viral entry and replication. The significant reduction in actin, associated with the presence of a myoepithelial cell with apoptotic characteristics, indicates that this cell issusceptible to viral infection and dies by apoptosis. The immunoexpression of EGF inGCTs was significantly higher in G5D, a possible attempt to repair the glandular tissuein the face of viral infection.