Taxonomia e filogenia dos gêneros Nitella e Chara (Charales, Charophyceae) baseada em dados moleculares e morfológicos com ênfase nas regiões sudeste e centro-oeste do Brasil

Abstract

A ordem Charales da classe Charophyceae inclui seis gêneros (Chara Linnaeus, Lamprothamnium J. Grove, Lychnothamnus (Ruprecht) Leonhardi, Nitella C. Agardh, Nitellopsis Hy e Tolypella A. Braun) classificados numa única família (Characeae). O sistema de classificação mais amplamente utilizado foi proposto por Wood & Imahori, é baseado em exclusivamente em caracteres morfológicos e considera que as Characeae formam um contínuo de espécies. As 400 espécies do grupo foram reduzidas a 81 com muitas variedades e formas. Muitos autores apontaram inconsistências no sistema de Wood & Imahori e sugeriram estudos com novas ferramentas (especialmente ultraestruturais e moleculares). No Brasil, foram reportados os gêneros Chara e Nitella, com abordagens essencialmente florísticas. Este trabalho teve por objetivo aplicar marcadores moleculares (sequências dos genes plastidiais que codificam a subunidade grande da enzima ribulose 1-5 bifosfato carboxilase/oxigenase, rbcL – o gene que codifica a enzima maturase K, matK; e os espaçadores nucleares 1 e 2 dos transcritos internos do DNA ribossômico, ITS1 e ITS2), bem como morfologia estrutural (todos caracteres morfológicos considerados diagnósticos) e ultraestrutural (microscopia eletrônica de varredura da ornamentação da parede dos oósporos), para: 1) caracterizar as espécies de Chara e Nitella com ênfase nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil; 2) inferir relações filogenéticas entre as espécies brasileiras de Chara e Nitella com as de outras regiões do globo; e 3) associar dados morfológicos, ultraestruturais da parede dos oósporos e moleculares, visando detectar os caracteres que permitem definir diferentes espécies reconhecidas, bem como propor eventuais caracteres novos. Foram geradas doze novas sequências para os marcadores rbcL e matK, e oito para ITS2 para seis espécies de Chara: Chara braunii, Chara foliolosa, Chara guairensis, Chara haitensis, Chara hydropitys e Chara rusbyana. Os dados reforçaram a visão de que alguns táxons infra-genéricos (como subgênero Charopsis e subsecção Willdenowia) não são naturais, enquanto algumas espécies (C. foliolosa, C. haitensis, C. hidropitys e C. rusbyana), anteriormente consideradas como variedades e formas de C. zeylanica, mostraram-se distintas nas análises dos três marcadores moleculares. Para Nitella geramos quarenta e duas novas sequências de rbcL, doze de ITS1 e vinte e três de ITS2 para cinco espécies: Nitella acuminata, Nitella axillaris, Nitella elegans, N. flagellifera e Nitella microcarpa. Dados sobre a parede oósporo confirmaram estudos prévios e os dados moleculares sugeriram a sinonimização de: Nitella subglomerata e Nitella gollmeriana com Nitella acuminata; e Nitella axilliformis com Nitella axillaris. A identidade entre as seqüências foi alta para os três marcadores, mesmo entre populações de Nitella geograficamente muito distantes, assim como a variação dentro de cada caráter morfológico analisado. Nossa primeira hipótese de que o número de espécies de Chara e Nitella descritas até o momento para as regiões Sudeste e Centro-Oeste encontra-se equivocado foi parcialmente comprovada, com redução devido à sinonimização de algumas espécies; porém, nenhuma espécie nova foi reconhecida. A segunda hipótese, que previa que algumas espécies de Chara e Nitella ocorrentes no Brasil apresentariam alta divergência de sequências, devido ao isolamento geográfico em período relativamente remoto, daquelas de outras regiões do mundo foi refutada.

The order Charales of the class Charophyceae includes six genera (Chara Linnaeus, Lamprothamnium J. Grove, Lychnothamnus (Ruprecht) Leonhardi, Nitella C. Agardh, Nitellopsis Hy and Tolypella A. Braun) classified in a single family (Characeae). The most widely used classification system, proposed by Wood and Imahori, is based exclusively on morphological characters and considers that within Characeae there is a continuum of species. The 400 species of the group were reduced to 81 with many varieties and forms. Many authors pointed out inconsistencies in this system and suggested studies applying new tools (especially ultrastructural and molecular). In Brazil, only the genera Chara and Nitella were reported, mostly in floristic studies. The aim of this investigation was to apply molecular markers (sequences of the plastid genes coding for the large subunit of the ribulose 1-5 biphosphate carboxylase/oxygenase enzyme, rbcL - and the maturase K enzyme coding gene, matK; internal transcriber spacer of nuclar ribosomal DNA, ITS1 and ITS2), as well as morphological (all diagnostic characters currently used) and ultrastructural (scanning electron microscopy of oospore wall ornamentation), to: 1) characterize the Chara and Nitella species with emphasis in the Midwest and Southeast regions of Brazil; 2) to infer phylogenetic relationships between the Brazilian species of Chara and Nitella with those from other regions of the globe; and 3) to associate morphological, ultrastructural oospore wall and molecular data, in order to determine characters that can be applied to define species, as well as to propose possible new characters. Twelve new sequences were generated for the rbcL and matK markers, and eight for ITS2 for six species of Chara: Chara braunii, Chara foliolosa, Chara guairensis, Chara haitensis, Chara hydropitys and Chara rusbyana. The data reinforced the view that some infra-generic taxa (such as Charopsis subgenus and Willdenowia subsection) are not natural, whereas some species (C. foliolosa, C. haitensis, C. hidropitys and C. rusbyana), previously considered as forms of C. zeylanica, were found to be distinct in the analyzes of the three molecular markers. For Nitella we generated forty-two new rbcL sequences, twelve of ITS1 and twenty-three of ITS2 for five species: Nitella acuminata, Nitella axillaris, Nitella elegans,Nitella flagellifera and Nitella microcarpa. Data on the oospore wall confirmed previous studies and the molecular evidences suggested the following synonyms: Nitella subglomerata and Nitella gollmeriana with Nitella acuminata; and Nitella axilliformis with Nitella axillaris. Identity values among the sequences were high for the three markers, even among populations of Nitella geographically very distant, with wide variation for morphological characters. Our first hypothesis that the number of Chara and Nitella species described so far for the Southeast and Midwest regions is equivocal was partially confirmed, with a reduction due to the proposal of synonyms for some species; however, no new species was recognized, contradicting the second part of this hypothesis. The second hypothesis, which predicted that some species of Chara and Nitella occurring in Brazil would present high sequence divergence due to ancient geographic isolation, from those of other regions of the world was refuted.