Micropartículas contendo nanopartículas de trans-resveratrol aplicadas ao tratamento de infecções por Helicobacter pylori
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Data
2024-04-25
Autores
Orientador
Chorilli, Marlus 
Coorientador
Bauab, Taís Maria
Meneguin, Andréia
Pós-graduação
Ciências Farmacêuticas - FCF 33004030078P6
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
O Helicobacter pylori (H. pylori) é um microrganismo diretamente ligado às condições clínicas graves que afetam o estômago. Os fatores de virulência e sua capacidade de formar biofilmes aumentam a resistência aos antibióticos convencionais, necessitando de novas substâncias e estratégias para o tratamento da infecção por esse patógeno. O trans-resveratrol (RESV), um polifenol bioativo de origem natural e tem potencial atividade contra esse patógeno gástrico. Considerando que o tempo de permanência das formas farmacêuticas convencionais no trato gastrointestinal é um dos principais fatores que prejudicam a biodisponibilidade dos fármacos, os sistemas de liberação gastrorrententivos estão sendo empregados com o intuito de aumentar o tempo de ação do fármaco no estômago, de forma a melhorar o sítio de ação específico. O objetivo desse estudo foi desenvolver micropartículas (MPs) compostas por ácido hialurônico (AH) e alginato de sódio (AS) visando a microencapsulação de nanopartículas (NPs) de quitosana (QTS) contendo RESV. Primeiramente foram desenvolvidas NPs pelo método de geleificação ionotrópica utilizando QTS e tripolifosfato de sódio (TPP) para encapsulação do RESV, as quais caracterizadas por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), Microscopia Eletrônica de Transmissão Criogênica (Cryo – TEM). Posteriormente foram obtidas MPs por spray drying e caracterizadas utilizando Microscopia eletrônica de Varredura (MEV). A eficiência de encapsulamento (EE) e a taxa de liberação in vitro do RESV foram quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O desempenho das formulações contra H. pylori foi avaliado pela quantificação das concentrações inibitórias/bactericidas mínimas (MIC/MBC), tempo de morte, alterações na morfologia do H. pylori em sua forma planctônica, efeitos contra o biofilme de H. pylori, em modelo de infecção in vitro e in vivo, além do ensaio de gastroproteção in vivo. A citotoxicidade foi avaliada contra linhagens celulares AGS e MKN-74 e por ensaio de hemólise. A toxicidade aguda foi testada utilizando ensaios em Galleria mellonella. Os dados obtidos demonstraram que as NPs obtidas usando a concentração de QTS (2mg/mL) e de TPP (1 mg/mL) na proporção de QTS:TPP (2,5:1, B-NP) foram bem sucedidas em relação ao diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), com valores de 154,2 nm, índice de polidispersão (IPD; 0,24) e potencial zeta (PZ; 22,6 mV). Os dados demonstraram que a adição do RESV (RESV-NP) alterou tanto o DHM (145,3 nm) quanto o IPD (0,28) das amostras e diminuiu o PZ (16,9 mV). As fotomicrografias obtidas por MET e MEV evidenciaram que tanto as RESV-NP, as MPs com RESV (RESV-MP) e as micro nanopartículas contendo RESV (RESV-MNP) apresentaram morfologia aproximadamente esférica e típica, com diâmetro ~ 153,2 nm, ~ 12 µm e ~ 2 µm respectivamente. A EE de RESV-NP foi de 72%, enquanto que para RESV-MP foi de 87,7% e 79,99% para RESV-MNP. No ensaio de liberação in vitro em meio gástrico as RESV-NP liberaram o fármaco incorporado logo nos primeiros 5 minutos de avaliação. Por sua vez, RESV-MP e RESV-MNP liberaram cerca de 41% do RESV nas primeiras 24 h, demonstrando um perfil de liberação prolongado das MPs comparado ao fármaco livre (100% em 30 minutos). Além disso RESV-NP e RESV-MP mostraram interação com a mucina de porco em ambiente gástrico, demonstrando importante caráter mucoadesivo. No ensaio de citotoxicidade, RESV-NP e RESV-MNP não demonstraram caráter tóxico na concentração de CIM para ambas as linhagens celulares (AGS e MKN-74) o que também foi encontrado no ensaio de toxicidade aguda em modelo alternativo de G. mellonella. Nos ensaios microbiológicos, o RESV-NP e RESV-MNP apresentaram CIM/MBC de 3,9 µg/mL enquanto RESV-MP CIM/CBM de 125 µg/mL. A erradicação completa da H. pylori ocorreu após 24 h para todas as formulações. Na concentração de 2xMIC (7,8 µg/mL), RESV-NP, RESV-MP e RESV-MNP erradicaram completamente o biofilme de H. pylori. Em modelo de infecção in vitro, RESV-NP, RESV-MP e RESV-MNP mostraram diminuição significativa na carga bacteriana quando comparado ao controle H. pylori J99. No ensaio de infecção in vivo utilizando G. mellonella, todas as formulações agiram efetivamente diminuindo a taxa de morte das larvas infectadas. RESV-MNP apresentou efeito gastroprotetor, uma vez que foi eficaz em diminuir a extensão e gravidade das lesões causadas por indometacina. Desta forma, pode-se concluir que as MPs contendo NPs de RESV mostraram-se promissoras no efeito gastroprotetor, sendo uma alternativa promissora em infecções causadas por H. pylori.
Resumo (inglês)
Helicobacter pylori (H. pylori) is a microorganism directly linked to serious clinical conditions that affect the stomach. Virulence factors and their ability to form biofilms increase resistance to conventional antibiotics, requiring new substances and strategies to treat infection by this pathogen. Trans-resveratrol (RESV), a bioactive polyphenol of natural origin, has potential activity against this gastric pathogen. Considering that the residence time of conventional pharmaceutical forms in the gastrointestinal tract is one of the main factors that impair the bioavailability of drugs, gastroretentive release systems are being used with the aim of increasing the drug's action time in the stomach, in order to improve the specific site of action. The objective of this study was to develop microparticles (MPs) composed of hyaluronic acid (HA) and sodium alginate (SA) aiming at the microencapsulation of chitosan nanoparticles (NPs) (QTS) containing RESV. Firstly, NPs were developed by the ionotropic gelation method using QTS and sodium tripolyphosphate (TPP) for RESV encapsulation, which were characterized by Dynamic Light Scattering (DLS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Cryogenic Transmission Electron Microscopy ( Cryo – TEM). MPs were subsequently obtained by spray drying and characterized using Scanning Electron Microscopy (SEM). The encapsulation efficiency (EE) and in vitro release rate of RESV were quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The performance of the formulations against H. pylori was evaluated by quantifying the minimum inhibitory/bactericidal concentrations (MIC/MBC), time to death, changes in the morphology of H. pylori in its planktonic form, effects against the H. pylori biofilm, in in vitro and in vivo infection model, in addition to the in vivo gastroprotection assay. Cytotoxicity was evaluated against AGS and MKN-74 cell lines and by hemolysis assay. Acute toxicity was tested using Galleria mellonella assays. The data obtained demonstrated that the NPs obtained using the concentration of QTS (2mg/mL) and TPP (1 mg/mL) in the ratio of QTS:TPP (2.5:1, B-NP) were successful in relation to mean hydrodynamic diameter (DHM), with values of 154.2 nm, polydispersity index (IPD; 0.24) and zeta potential (PZ; 22.6 mV). The data demonstrated that the addition of RESV (RESV-NP) changed both the DHM (145.3 nm) and the IPD (0.28) of the samples and decreased the PZ (16.9 mV). The photomicrographs obtained by TEM and SEM showed that both the RESV-NP, the MPs with RESV (RESV-MP) and the micro nanoparticles containing RESV (RESV-MNP) presented an approximately spherical and typical morphology, with a diameter ~ 153.2 nm, ~12 µm and ~2 µm respectively. The EE of RESV-NP was 72%, while that for RESV-MP was 87.7% and 79.99% for RESV-MNP. In the in vitro release test in the gastric environment, RESV-NP released the incorporated drug within the first 5 minutes of evaluation. In turn, RESV-MP and RESV-MNP released approximately 41% of RESV in the first 24 h, demonstrating a prolonged release profile of MPs compared to the free drug (100% in 30 minutes). Furthermore, RESV-NP and RESV-MP showed interaction with pig mucin in the gastric environment, demonstrating an important mucoadhesive character. In the cytotoxicity test, RESV-NP and RESV-MNP did not demonstrate a toxic nature at the MIC concentration for both cell lines (AGS and MKN-74), which was also found in the acute toxicity test in an alternative model of G. mellonella. In microbiological assays, RESV-NP and RESV-MNP presented MIC/MBC of 3.9 µg/mL while RESV-MP MIC/MBC of 125 µg/mL. Complete eradication of H. pylori occurred after 24 h for all formulations. At a concentration of 2xMIC (7.8 µg/mL), RESV-NP, RESV-MP and RESV-MNP completely eradicated the H. pylori biofilm. In an in vitro infection model, RESV-NP, RESV-MP and RESV-MNP showed a significant decrease in bacterial load when compared to the H. pylori J99 control. In the in vivo infection assay using G. mellonella, all formulations acted effectively reducing the death rate of infected larvae. RESV-MNP had a gastroprotective effect, as it was effective in reducing the extent and severity of injuries caused by indomethacin. Therefore, it can be concluded that MPs containing RESV NPs showed promise in their gastroprotective effect, being a promising alternative in infections caused by H. pylori.
Descrição
Idioma
Português