Expressão da proteína S1 recombinante do vírus da bronquite infecciosa em Saccharomyces cerevisiae para aplicação no imunodiagnóstico

Abstract

A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI.

The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus.