Análise de esteróides isolados do veneno de Rhinella marina (Sapo-cururu) na indução de apoptose em câncer cervical associado ao Papilomavírus Humano (HPV)

Abstract

O câncer cervical é o terceiro tipo mais comum entre as doenças oncológicas femininas no mundo. A cada ano, mais de 300.000 mortes são registradas por câncer do colo do útero associado ao vírus do papiloma humano (HPV), que por sua vez é um dos principais agentes das infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), que infectam mais de 80% das pessoas em algum momento de suas vidas. Embora 90% das infecções por HPV regridam naturalmente em dois anos, 10 a 20% terão uma infecção persistente. Considerando a baixa adesão vacinal em todo o mundo e a ausência de uma terapia antiviral comercial, o uso de compostos naturais, direcionados às vias celulares que são desreguladas pela infecção pelo HPV, pode ser relevante para a descoberta de novos fármacos. Rhinella marina também conhecida popularmente como sapo-cururu é uma das espécies venenosas mais encontradas no continente australiano e na América do Sul, cujo veneno é extraído para o isolamento de inúmeras substâncias puras. Vários estudos tem avaliado compostos isolados do veneno do sapo-cururu australiano, retirado da secreção da glândula parótida, que contêm compostos denominados bufadienolideos, contendo marinobufagina (MBG) (C24H32O5), telocinobufagina (TBG) (C24H34O5) e bufadienotoxinas como a marinobufotoxina (MBT) (C38H56N4O9). Neste estudo, as linhagens celulares de câncer cervical HPV positivas (SiHa e CasKi), HPV negativas (C-33A) e queratinócitos da pele imortalizados espontaneamente (HaCaT) foram tratadas com MBG, TBG e MBT. A citotoxicidade foi avaliada em diferentes concentrações (7,81uM, 15,62uM, 31,25uM, 62,50uM e 125uM), realizada pelo do ensaio MTT. Concentrações capazes de inibir a viabilidade celular em 50% das células tratadas, bem como o índice de seletividade (IS) foram calculados para todos os experimentos. Em seguida, foi avaliado o potencial apoptótico pela determinação dos níveis de caspases 3/7, por luminescência (Promega). O ensaio de MTT demonstrou menor viabilidade das células SiHa tratadas com MBG (CI50 de 12,4uM, IS de 12,89). Os níveis das caspase 3/7 foram significativamente maiores para células SiHa tratadas com MBG, quando comparados às demais linhagens celulares. Portanto, MBG foi a substância que apresentou maior capacidade de reduzir a viabilidade celular, em 24 horas de tratamento (CI50 12,4uM), induzindo apoptose dependente de caspases para células SiHa. Os resultados foram confirmados posteriormente por imagens de fluorescência utilizando Hoescht e LDR. Em conclusão, a MBG demonstrou um efeito apoptótico seletivo para células SiHa e deve ser explorado futuramente como um potencial agente terapêutico para o câncer cervical associado ao HPV16.

Cervical cancer is the third most common type of female cancer in the world. Each year, more than 300,000 deaths are recorded from cervical cancer associated with the human papilloma virus (HPV), which in turn is an important sexually transmitted transmission agent (STIs) which infect more than 80% of people at some point in their lives. Although 90% of HPV infections naturally regress within years, 10 to 20% will have a persistent infection. Considering the low vaccine adherence worldwide and the absence of commercial antiviral therapy, the use of natural compounds, targeted at cellular pathways that are deregulated by HPV infection, may be relevant for the discovery of new drugs. Rhinella marina, also popularly known as frog-cururu, is one of the most poisonous species found on the Australian continent and in South America, whose poison is extracted for the isolation of numerous pure substances. Several studies have evaluated compounds isolated from the poison of the Australian cane toad, removed from the secretion of the parotid gland, which contain compounds called bufadienolides, containing marinobufagin (MBG) (C24H32O5), telocinobufagin (TBG) (C24H34O5) and bufadienotoxins suck as marinobufotoxin (MBT) (C38H56N4O9). In this study, HPV positive (SiHa and CasKi), HPV negative (C-33A) and spontaneously immortalized skin keratinocytes (HaCaT) cervical cancer cell lines were treated with MBG, TBG and MBT. Cytotoxicity was evaluated at different concentrations (7.81uM, 15.62uM, 31.25uM, 62.50uM and 125uM), performed using the MTT assay. Concentrations capable of inhibiting cell viability in 50% of treated cells, as well as the selectivity index (SI) were calculated for all experiments. Then, the apoptotic potential was evaluated by determining the levels of caspases 3/7, by luminescence (Promega). The MTT assay demonstrated lower viability for MBG-treated SiHa cells (IC50 12.4uM, IS 12.89). Caspase 3/7 levels were significantly higher for MBG-treated SiHa cells when compared to other cell lines. Therefore, MBG was the substance that showed the greatest capacity to reduce cell viability, in 24 hours of treatment (IC50 12.4uM), inducing caspase-dependent apoptosis for SiHa cells. Results were further confirmed by fluorescence imaging using Hoescht and LDR. In conclusion, MBG demonstrated a selective apoptotic effect for SiHa cells and should be explored in the future as a potential therapeutic agent for cervical cancer associated with HPV16.