Publicação: Avaliação do potencial de lipossomas funcionalizados com transferrina para veiculação de docetaxel para o tratamento do câncer de próstata
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Data
2019-12-10
Autores
Orientador
Chorilli, Marlus
Coorientador
Pós-graduação
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCF
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
O câncer de próstata (CP) é a neoplasia maligna urológica mais comum e a segunda principal causa de mortalidade de homens associada ao câncer no mundo. O tratamento é iniciado por meio de intervenções cirúrgicas que abrangem a prostatectomia radical, tratamentos radioterápicos, terapias envolvendo privação androgênica e as imunoterapias. A quimioterapia também é bastante utilizada e recentes estudos demonstraram um controle notável do crescimento do CP utilizando docetaxel (DTX). No entanto, o DTX apresenta efeitos colaterais associados à toxicidade, tanto do fármaco como da formulação, Taxotere®. Em consequência disso, o desenvolvimento de sistemas nanotecnológicos de liberação de fármacos, como lipossomas, tem sido promissor para o tratamento do CP, em virtude das múltiplas características favoráveis desses nanosistemas, como biocompatibilidade e biodegradabilidade. Uma abordagem atrativa é a modificação superficial dos lipossomas com ligantes específicos dos receptores regulados nas superfícies de células tumorais, como os receptores de transferrina, que podem ser superexpressos em células tumorais de próstata. O atual trabalho visou desenvolver, caracterizar e avaliar a citotoxicidade in vitro de lipossomas funcionalizados com transferrina para veiculação do DTX no tratamento do CP. Os lipossomas foram obtidos por meio da técnica clássica da hidratação do filme lipídico e foram constituídos pela mistura de fosfatidilcolina de soja (SPC): colesterol (Col) : DSPE-PEG (2000)-Maleimida e SPC:Col:DSPE-PEG (2000)-Maleimida:DTX, nas proporções molares 10:2:0.78 e 10:2:0.78:0.52, respectivamente. As caracterizações foram realizadas a partir das formulações vazias e com DTX antes e após o processo de funcionalização. Foram realizadas análises do diâmetro médio da partícula, índice de polidispersidade (IPD) e potencial zeta (PZ) empregando o equipamento Dinamic Light Scattering (DLS) e análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os valores do diâmetro médio obtidos se mantiveram menores que 100nm, o IPD em 0,400 e o PZ entre -23,06 a -21,2mV. Por meio da MET foi possível comprovar a morfologia esférica da vesícula, corroborando o tamanho obtido pela técnica de DLS. Foram realizadas análises da concentração por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA). O processo de funcionalização foi obtido com sucesso e as estruturas primárias, secundárias e terciárias da transferrina avaliadas por SDS-PAGE, dicroísmo circular e por espectroscopia de fluorescência confirmaram que o processo não alterou a sua integridade. A eficiência de funcionalização foi de 31% avaliada pelo ensaio BCA. Para avaliar a eficiência de encapsulação e a liberação do DTX a metodologia analítica foi validada por cromatografia liquida de alta eficiência. Verificou-se que 69 e 37% de DTX estava encapsulado nos lipossomas sem e com funcionalização, respectivamente. O ensaio de liberação foi realizado em PBS pH 7,4 com 1,25% de lauril sulfato de sódio utilizando membranas de diálise de celulose de peso molecular 12-14kDa para o fármaco livre, sistemas funcionalizados (B) e não funcionalizados (D) contendo docetaxel. A difusão do fármaco livre através da membrana foi superior a 60% após 72 horas de estudo, demonstrando que a liberação do DTX não foi limitada pela membrana de diálise. No caso dos lipossomas, a liberação de DTX foi de 51,70% e 31,97% para os lipossomas não funcionalizados e funcionalizados, respectivamente. Os ensaios de citotoxicidade in vitro e uptake celular em linhagens PC-3 e PNT2 sugerem que os lipossomas vazios e vazios funcionalizados não são tóxicos às linhagens testadas; no entanto, os lipossomas carregados com DTX apresentaram elevada toxicidade em ambas as linhagens. Através do ensaio de microscopia confocal e citometria de fluxo foi possível comprovar que os lipossomas funcionalizados apresentaram uptake pronunciado em linhagem PC3. Pode-se comprovar também a interação desses sistemas com os TfR’s superexpressos na superfície celular através da QCM-D. Os resultados obtidos evidenciam que os lipossomas funcionalizados com transferrina são uma estratégia promissora para entrega de docetaxel, porém estudos adicionais em modelo celular tridimensional e in vivo são necessários.
Resumo (inglês)
Prostate cancer (PC) is the most common urological malignancy and the second leading cause of cancer-related mortality in men worldwide. Treatment is initiated through surgical interventions that include radical prostatectomy, radiotherapy treatments, androgen deprivation therapies and immunotherapies. Chemotherapy is also widely used and recent studies have shown remarkable control of CP growth using docetaxel (DTX). However, DTX has side effects associated with the toxicity of both the drug and the formulation Taxotere®. As a result, the development of nanotechnological drug delivery systems, such as liposomes, has been promising for the treatment of CP, due to the multiple favorable characteristics of these nanosystems, such as biocompatibility and biodegradability. An attractive approach is the superficial modification of liposomes with receptor-specific ligands regulated on tumor cell surfaces, such as transferrin receptors, which can be overexpressed in prostate tumor cells. The present work aimed to develop, characterize and evaluate the in vitro cytotoxicity of transferrinfunctionalized liposomes for DTX delivery in the treatment of CP. The liposomes were obtained by the classical technique of hydration of the lipid film and consisted of soybean phosphatidylcholine (SPC): cholesterol (Col): DSPE-PEG (2000) -Maleimide and SPC: Col: DSPE-PEG (2000) mixture. ) -Maleimide: DTX, in the molar ratios 10: 2: 0.78 and 10: 2: 0.78: 0.52, respectively. The characterizations were performed from the empty formulations and with DTX before and after the functionalization process. Particle average diameter, polydispersity index (IPD) and zeta potential (PZ) analyzes were performed using the Dinamic Light Scattering (DLS) and morphological analysis by transmission electron microscopy (MET). The average diameter values obtained remained below 100nm, the IPD at 0.400 and the PZ between -23.06 to -21.2mV. Through MET it was possible to prove the spherical morphology of the gall bladder, corroborating the size obtained by the DLS technique. Concentration analyzes were performed by Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The functionalization process was successfully obtained and the primary, secondary and tertiary transferrin structures evaluated by SDS-PAGE, circular dichroism and fluorescence spectroscopy confirmed that the process did not alter its integrity. Functionalization efficiency was 31% evaluated by the BCA assay. To evaluate the encapsulation efficiency and DTX release the analytical methodology was validated by high performance liquid chromatography. 69 and 37% of DTX were found to be encapsulated in liposomes without and with functionalization, respectively. The release assay was performed in PBS pH 7.4 with 1.25% sodium lauryl sulfate using 12-14kDa molecular weight cellulose dialysis membranes for free drug, functionalized (B) and non-functionalized (D) systems. containing docetaxel. Free drug diffusion across the membrane was greater than 60% after 72 hours of study, demonstrating that DTX release was not limited by the dialysis membrane. In the case of liposomes, DTX release was 51.70% and 31.97% for nonfunctionalized and functionalized liposomes, respectively. In vitro cytotoxicity and cell uptake assays in PC-3 and PNT2 strains suggest that empty and functionalized empty liposomes are not toxic to the strains tested; however, DTX-loaded liposomes showed high toxicity in both strains. Through the confocal microscopy and flow cytometry assay it was possible to prove that the functionalized liposomes presented pronounced uptake in PC3 strain. The interaction of these systems with the overexpressed TfRs on the cell surface through QCM-D can also be proven. The results obtained show that transferrin-functionalized liposomes are a promising strategy for the delivery of docetaxel, however additional studies in three-dimensional and in vivo cell models are necessary.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
