Publicação: Estudo das interações moleculares da proteína 14-3-3 de Paraoccidioides brasiliensis
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Data
Autores
Orientador
Fusco-Almeida, Ana Marisa
Coorientador
Pós-graduação
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCF
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de grande importância na América Latina devido a incidência. Durante a interação com o hospedeiro, P. brasiliensis sintetiza diversas moléculas que auxiliam no processo infeccioso, entre elas, a proteína Pb14-3-3 desempenha um importante papel no estabelecimento da infecção. Este estudo teve como objetivo aprofundar o conhecimento sobre esta proteína através de caracterização biofísica e estrutural, identificar proteínas ligantes tanto de P. brasiliensis quanto de células humanas e avaliar seu potencial imunogênico em G. mellonella. Para isso, a proteína Pb14-3-3 recombinante foi produzida e purificada por técnicas cromatográficas. O conteúdo de estrutura secundária e a avaliação da estrutura terciária foram avaliados por dicroísmo circular e fluorescência intrínseca do triptofano, respectivamente onde foi observado que a proteína obtida é composta majoritariamente por estruturas α-hélices e apresenta estrutura terciária. A estabilidade térmica também foi avaliada e a Pb14-3-3 recombinante mantém sua estrutura secundária até a temperatura 55°C, temperatura muito superior as utilizadas nos experimentos posteriores. A resolução da estrutura tridimensional por cristalografia de raios-X demonstrou que a proteína é composta por nove estruturas α-hélices dispostas em arranjo antiparalelo, formando um canal de ligação característico das proteínas da família 14-3-3. Curiosamente, observou-se que durante o processo de cristalização a Pb14-3-3 interage com um peptídeo, que se dissocia com a adição de glutaraldeído na solução de cristalização. A sequência do peptídeo foi predita in silico e este apresentou o motivo de ligação modo II predito para proteínas 14-3-3. Os ensaios de interação proteína-proteína demonstraram que a Pb14-3-3 interage com um grande número de proteínas tanto de P. brasiliensis e quanto de células hospedeiras (ATCC MRC-5). Entre as proteínas de P. brasiliensis, identificou-se duas proteínas da família Hsp70 (heat shock proteins), Hsp7 e Hsp72, estas proteínas estão envolvidas na patogenicidade de P. brasiliensis, porém o papel dessa interação na patogenicidade ainda deve ser elucidado. A α-tubulina de ATCC MRC-5, proteína do citoesqueleto, também foi identificada como ligante de Pb14-3-3, sugerindo o envolvimento desta proteína no rearranjo do citoesqueleto de células hospedeiras mediante a infecção por P. brasiliensis, que é considerado um mecanismo de evasão do sistema imune. Adicionalmente, neste trabalho também foi realizada a avaliação do efeito do tratamento da Pb14-3-3 em G. mellonella e observou-se que o pré-tratamento com a proteína promoveu um efeito protetivo contra a infecção por P. brasiliensis e que a Pb14-3-3 desempenha um papel imunomodulatório promovendo a diminuição da densidade hemocitária e o aumento na produção de óxido nítrico e na expressão de peptídeos antifúngicos. Desta forma, este estudo reforça a importância desta proteína na interação Paracoccidioides-hospedeiro, sugerindo seu envolvimento no rearranjo do citoesqueleto e seu potencial como alvo terapêutico.
Resumo (português)
Paracoccidioides brasiliensis is one the etiological agents of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of great importance in Latin America due its incidence. During the interaction with the host, P. brasiliensis synthetizes several molecules that assist in the infectious process, among them the Pb14-3-3 plays a crucial role in the establishment of the infection. This study aimed to increase the knowledge about this protein by performing the biophysical and structural characterization, identify binding protein from P. brasiliensis and host cells and evaluate its immunogenic potential in G. mellonella. For this, the Pb14-3-3 recombinant protein was produced in E. coli and purified by chromatography techniques. The secondary structure content and evaluation of tertiary structure was performed by circular dichroism and intrinsic tryptophan fluorescence, respectively and it was observed that the obtained protein is mainly composed by structures and presents tertiary structure. The thermal stability was also evaluated and the Pb14-3-3 recombinant protein maintains its secondary structure until 55°C, which is higher than the temperatures used in subsequent experiments. The resolution of the 3D structure by X-ray crystallography revealed that the protein is composed by nine α-helix, in antiparallel arrangement, forming a binding groove that is characteristic from 14-3-3 proteins family; Interestingly, it was observed that during the crystallization process the Pb14-3-3 interacts with a peptide, which dissociates when crosslinked with glutaraldehyde. The peptide sequence was predicted in silico and presented the binding motif mode II proposed for 14-3-3 proteins. The interactions assays showed that Pb14-3-3 interacts with several proteins from both P. brasiliensis and host cells (ATCC MRC-5). Among the biding proteins from P. brasiliensis, two proteins from Hsp70 (Heat Shock Proteins) family were identified, Hsp7 and Hsp72, these proteins are involved in P. brasiliensis pathogenicity, but its role of this interaction in the pathogenicity is not clear yet. The α-tubulin protein from ATCC MRC-5, a cytoskeleton protein, was also identified as Pb14-3-3 binding partner, suggesting the role of this protein in the cytoskeleton rearrangement promoted by P. brasiliensis as an evasion mechanism from host immune system. Additionally, the effect of Pb14-3-3 treatment in Galleria mellonella was also evaluated and it was observed that the pre-treatment protects larvae against P. brasiliensis infection and Pb14-3-3 has an immunomodulatory effect leading to a decrease of hemocyte density, increases the production of oxide nitric and the expression of antifungal peptides coding genes. Therefore, this study reinforces the importance of Pb14-3-3 in the Paracoccidioides-host interaction, suggests its involvement in the cytoskeleton rearrangement and its potential as therapeutic target.
Descrição
Palavras-chave
Paracoccidioides brasiliensis, proteína 14-3-3, adesina, 14-3-3 protein, adhesin
Idioma
Português
