Avaliação da formação de biofilme de Paracoccidioides brasiliensis em modelo tridimensional de esferoide quanto ao papel da adesina 14-3-3 e formas de controle

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada pelo fungo patogênico termodimórfico do gênero Paracoccidioides. Vários fatores determinantes da virulência, como o dimorfismo, mudanças na composição da parede celular, adesinas e a formação de biofilme, têm sido relatados e podem desempenhar papel relevante em sua patogênese. A relevância dos biofilmes para as infecções humanas precisa ser mais bem estudada no âmbito de modelos in vitro, ex vivo e in vivo, com foco em demonstrar fatores relacionados à sua formação, à virulência e a fármacos antibiofilmes, como, por exemplo, modelos de cultura celular tridimensional (3D) mais fiéis ao que é observado em modelos in vivo. Neste contexto, entende-se a importância de avaliar o papel da adesina 14-3-3 em P. brasiliensis na formação de biofilme, comparando o isolado atenuado (aPb18) com o virulento (vPb18) em queratinócitos de pele humana (HaCaT) e fibroblastos dérmicos humanos (HDFa) em modelo tridimensional (3D), com ênfase na paracoccidioidomicose cutânea e na aplicação de estratégias de controle. Para isso, biofilmes foram formados e caracterizados para posterior infecção em modelos tridimensionais de esferoide, de pele reconstruída e de fio de sutura. Além disso, RT-qPCR, microscopia eletrônica de varredura e de fluorescência confocal, foram utilizadas para visualização e análise dessas interações. A isolado vPb18 apresentou maior capacidade de formação de biofilme, com estruturas mais densas e organizadas, maior produção de matriz extracelular e maior virulência nos modelos de Galleria mellonella, esferoides celulares e pele humana reconstruída, quando comparada à aPb18. As análises de RT-qPCR indicaram diferenças no perfil de expressão gênica, principalmente em condições planctônicas, para 14-3-3 e GEL3, sugerindo associação com as fases iniciais de crescimento e de adaptação celular. Porém, os outros genes analisados — 14-3-3, GEL3, enolase e Fsk1 — não apresentaram diferenças expressivas entre os biofilmes e a pele infectada em ambos os isolados. Adicionalmente, o composto L7CF182 mostrou atividade contra células planctônicas, mas baixa eficácia, na mesma concentração, frente aos biofilmes, reforçando a importância do estudo desse modo de crescimento e da busca por novas estratégias antifúngicas.

Abstract (english)

Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by the thermodimorphic pathogenic fungus of the genus Paracoccidioides. Several virulence determinants, including dimorphism, changes in cell wall composition, adhesins, and biofilm formation, have been reported and may play a significant role in its pathogenesis. The relevance of biofilms in human infections still needs to be further investigated using in vitro, ex vivo, and in vivo models, with a focus on identifying factors related to their formation, virulence, and the development of antibiofilm drugs. For example, threedimensional (3D) cell culture models are considered more representative of what is observed in vitro systems. In this context, it is important to evaluate the role of the 14-3-3 adhesin in P. brasiliensis during biofilm formation, comparing the attenuated strain (aPb18) with the virulent strain (vPb18) in human skin keratinocytes (HaCaT) and human dermal fibroblasts (HDFa) using a three-dimensional (3D) model, with emphasis on cutaneous paracoccidioidomycosis and the application of control strategies. For this purpose, biofilms were formed and characterized prior to infection in three-dimensional spheroid models, reconstructed skin, and suture thread models. In addition, RT-qPCR, scanning electron microscopy, and confocal fluorescence microscopy were used to visualize and analyze these interactions. The vPb18 strain showed greater biofilm-forming capacity, with denser, more organized structures and increased extracellular matrix production, as well as higher virulence in Galleria mellonella, cellular spheroids, and reconstructed human skin models, compared with aPb18. RT-qPCR analyses indicated differences in gene expression profiles, mainly under planktonic conditions, for 14-3-3 and GEL3, suggesting an association with early growth stages and cellular adaptation. However, the other genes analyzed — 14-3-3, GEL3, enolase, and Fks1 — did not show significant differences in biofilms or infected skin between the two strains. This result was obtained after 120 h of biofilm growth and could explain this result. Additionally, the compound L7CF182 showed activity against planktonic cells but low efficacy against biofilms, underscoring the importance of studying this growth mode and the need to develop new antifungal strategies.

Keywords

Paracoccidioidomicose cutânea , Biofilmes , Adesina 14-3-3 , 1,3-β-glucana , Modelos de cultura 3D , Paracoccidioidomicose , Técnicas de cultura de Células , Micoses , Cutaneous paracoccidioidomycosis , Biofilm , 3D culture models

Language

Portuguese

Citation

MARTINS, Henrique Gomes. Avaliação da formação de biofilme de Paracoccidioides brasiliensis em modelo tridimensional de esferoide quanto ao papel da adesina 14-3-3 e formas de controle. 2026. 83 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) – Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2026.