Publicação: Produção de anticorpos monoclonais para imunodiagnóstico de paracoccidioidomicose causada por Paracoccidioides lutzii
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Data
Autores
Orientador
Moroz, Andrei
Coorientador
Pós-graduação
Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos (Mestrado Profissional) - FCF
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Doenças relacionadas ao reino Fungi vem aumentando consideravelmente devido as alterações do sistema imunológico, resultando em 1,5 a 2 milhões de mortes por ano. Uma destas é a paracoccidioidomicose (PCM) - uma micose sistêmica, endêmica da América Latina causada por P. brasiliensis e espécies relacionadas como o P. lutzii. Com a descoberta de novas espécies de Paracoccidioides spp e sua alta variabilidade antigênica, seu diagnóstico pode ter um número substancial de resultados falsos negativos. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas capazes de reconhecer antígenos diferencialmente expressos é de suma importância. Com a finalidade de melhorar parâmetros sorológicos para o diagnóstico de PCM causado por P. lutzii, este estudo apresenta uma estratégia inovadora de imunização, que visa a obtenção de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer epítopos antigênicos específicos. Para isto, foi utilizada a técnica de imunização subtrativa de múltiplas tolerizações, utilizando como tolerógeno antígenos livres da parede do fungo (CFA) derivado de P. brasiliensis e como imunógeno o CFA derivado de P. lutzii. A ciclofosfamida foi empregada durante as etapas de tolerização, a fim de depletar linfócitos T e B responsivos a epítopos antigênicos de P. brasiliensis, aumentando o direcionamento da resposta imune a epítopos determinantes de P. lutzii. A obtenção do CFA de ambas as espécies de Paracoccidioides foi conduzida com sucesso e através dos ensaios de eletroforese e western blotting, pode-se constatar que o material antigênico de P. brasiliensis e P. lutzii possui um vasto repertório de conteúdo proteico, otimizando seu emprego para a obtenção de anticorpos monoclonais voltados a novos biomarcadores da doença. Durante a execução do protocolo subtrativo, a dose do fármaco empregada (200 mg/kg) foi altamente tóxica para os camundongos, culminando com a mortalidade de 100% destes antes do término da etapa de tolerização. Dessa maneira, um segundo protocolo de imunização foi realizado, utilizando uma dose menor (150 mg/kg) que demonstrou diminuição dos efeitos colaterais, prologando a sobrevida desses, embora tenha sido ineficiente em mantê-los vivos até o final do protocolo. Assim, padronizou-se o protocolo com doses de 100 mg/kg, o qual garantiu a sobrevivência dos animais, enquanto apresentou resultados satisfatórios quanto a imunossupressão dos mesmos. A reatividade do soro policlonal dos camundongos submetidos a imunização demonstrou baixa reatividade pelo tolerógeno, predizendo que múltiplos ciclos de tolerização culminam com a depleção de linfócitos T e B reativos a antígenos não desejados, como era esperado. Os hibridomas gerados na fusão celular apresentaram resultados promissores em seus screenings para 32 diferentes hibridomas policlonais, dos quais três foram selecionados para clonagem devido a sua alta reatividade aos antígenos de P. lutzii quando comparada aos antígenos de P. brasiliensis. Da clonagem, foi obtido um clone único com reatividade não exclusiva a P. lutzii, mas, ainda assim, com potencial uso no diagnóstico da doença.
Resumo (português)
Diseases related to the Fungi kingdom are increasing considerably due to changes in the immune system, resulting in 1.5 to 2 million deaths per year. One of these is paracoccidioidomycosis (PCM) - a systemic mycosis, endemic to Latin America caused by P. brasiliensis and related species such as P. lutzii. With the discovery of new species of Paracoccidioides spp and their high antigenic variability, their diagnosis can have a substantial number of false negative results. Thus, the development of new tools capable of recognizing differentially expressed antigens is of paramount importance. To improve serological parameters for the diagnosis of PCM caused by P. lutzii, this study presents a novel immunization strategy, which aims to obtain monoclonal antibodies capable of recognizing specific antigenic epitopes. For this, the technique of multiple tolerations subtractive immunization was used, using as tolerogen the fungal wall antigens (CFA) derived from P. brasiliensis and as immunogen the CFA derived from P. lutzii. Cyclophosphamide was used during the toleration steps to deplete T and B lymphocytes responsive to P. brasiliensis antigenic epitopes, increasing the targeting of the immune response towards P. lutzii determinant epitopes. CFA of both species of Paracoccidioides was successfully obtained and through electrophoresis and western blotting assays, it can be seen that the antigenic material of P. brasiliensis and P. lutzii has a vast repertoire of protein content, optimizing its use to obtaining monoclonal antibodies and new disease biomarkers. During the execution of the subtractive protocol, the dose of the drug used (200 mg / kg) was highly toxic to the mice, culminating in 100% mortality before the end of the tolerization stage. In this way, a second immunization protocol was performed, using a lower dose (150 mg / kg) that demonstrated a decrease in side effects, extending their survival, although it was inefficient in keeping them alive until the end of the protocol. Thus, the protocol was standardized with doses of 100 mg / kg, which guaranteed the survival of the animals, while presenting satisfactory results regarding their immunosuppression. The reactivity of the polyclonal serum of mice submitted to immunization demonstrated low reactivity to the tolerogen, predicting that multiple cycles of toleration results in the depletion of T and B lymphocytes reactive to unwanted antigens, as expected. The hybridomas generated in cell fusion showed promising results in their screenings for 32 different polyclonal hybridomas, of which three were selected for cloning due to their high reactivity to P. lutzii antigens when compared to P. brasiliensis antigens. From cloning, a single clone was established with reactivity not exclusive to P. lutzii, but, even so, with potential use in the diagnosis of the disease.
Descrição
Palavras-chave
anticorpos monoclonais, imunização, paracoccidioidomicose, monoclonal antibodies, immunization, paracoccidioidomycosis
Idioma
Português
