Publicação: Extração e purificação da proteína PSPA de Streptococcus pneumoniae utilizando surfactantes iônicos
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Data
Autores
Orientador
Ebinuma, Valéria de Carvalho Santos
Coorientador
Pós-graduação
Curso de graduação
Farmácia - FCF
Título da Revista
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Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno de pneumonia e meningite. Atualmente, as vacinas disponíveis no Brasil para essas doenças se baseiam em polissacarídeos capsulares (CPS), que induzem a resposta imune timo-dependente. Porém, tais vacinas têm alto custo de produção o que resulta em baixa cobertura vacinal. Várias proteínas pneumocócicas foram identificadas como potenciais candidatas à vacina, como a proteína A de superfície pneumocócica (PspA), particularmente a proteína A de superfície do pneumococo do clado 4 (PspA4Pro). Esta, se mostrou capaz de induzir anticorpos com alta reatividade cruzada entre as diferentes PspA, ou seja, é uma candidata com maior chance de cobertura vacinal. Para a produção dessa proteína em larga escala a custos menores, que viabiliza criação de vacinas com potencial de mercado, bactérias como Escherichia coli são os sistemas de expressão heteróloga de PspA4Pro bastante comuns. Uma vez que a proteína PspA é produzida intracelularmente, é necessário o rompimento celular e/ou permeabilização da célula para sua recuperação, seguida por etapas de purificação e segurança biológica para então sua aplicação clínica. Dentre os processos de rompimento celular, pode-se empregar compostos anfifílicos (tensoativos) como agentes de ruptura celular alternativos e eficazes para a permeabilização e recuperação de proteínas recombinantes intracelulares de E. coli sem dano funcional. Neste trabalho, avaliou-se a aptidão de compostos tensoativos na recuperação de PspA4Pro de células recombinantes de E. coli, a saber: cloreto de tributil-1-tetradecilfosfônio ([P4,4,4,14]Cl), brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB), Dodecil sulfato de sódio (SDS) e polioxiletileno p-t-octil fenol (Triton X-114). Para tanto, uma porção de biomassa de E. coli BL21(DE3) pET37b foram homogeneizados em soluções aquosas (0,25 mol.L-1) dos tensoativos durante 1 h, a 25°C e 50,0 RPM em agitador orbital. Em seguida, o extrato foi clarificado e o sobrenadante incubado em tampão de Laemmli 2:1 (v/v) com β-mercaptoetanol e, em seguida, aplicadas em eletroforese desnaturante (5% e 12% (m/m)) SDS-PAGE. Como controle positivo da extração de proteínas foi aplicado um método mecânico por sonda de ultrassom (US). Os géis foram revelados pelo corante Coomassie Brilliant Blue e escaneados pelo GelDoc® XR+ BioRad®. Os resultados mostraram que a adição dos tensoativos carregados [P4,4,4,14]Cl e CTAB e o tensoativo não-iônico Triton X-114 foram eficazes para recuperar a PspA4Pro, permitindo sua pré-purificação. Assim, o método de permeabilização celular empregando tensoativos pode ser um processo potencialmente eficaz para a recuperação de proteínas recombinantes.
Resumo (português)
Streptococcus pneumoniae is an important pathogen of pneumonia and meningitis. Currently, vaccines available in Brazil for these diseases are based on capsular polysaccharides (CPS), which induce a thymus-dependent immune response. However, such vaccines have a high production cost, which results in low vaccine protection. Pneumococcal proteins were identified as potentially cross-linked protein to the vaccine, especially the pneumococcal surface protein A (PspA), particularly, pneumococcal surface protein A for 4th clade, PspA4Pro, that proved be capable of producing high reactivity between the different PspA is, since it is a candidate with a greater chance of vaccine coverage. For the production of this protein on a large scale at lower costs, which makes it possible to create vaccines with market potential, bacteria such as Escherichia coli are the very common heterologous expression systems of PspA4Pro. Once the PspA protein is produced intracellularly, cell disruption and/or cell permeabilization is necessary for its recovery, followed by purification and biological safety steps for its clinical application. Among the cell disruption processes, amphiphilic compounds (surfactants) can be used as alternative and effective cell disruption agents for permeabilization and recovery of intracellular recombinant proteins of E. coli without functional damage. In this work, the ability of surface-active compounds to recover PspA4Pro from recombinant E. coli biomass was evaluated, namely: tributyl-1-tetradecylphosphonium chloride ([P4,4,4,14]Cl), hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS) and polyoxylethylene p-t-octyl phenol (Triton X-114). For that, a portion of E. coli BL21(DE3) pET37b biomass was homogenized in aqueous solutions (0.25 mol.L-1) of the surfactants for 1 h, at 25°C and 50.0 RPM in an orbital shaker. Following, the extract was clarified and the supernatant was incubated in Laemmli buffer 2:1 (v/v) with β-mercaptoethanol and then applied in denaturing electrophoresis (5% and 12% (w/w)) SDS- PAGE As a positive control of protein extraction, a mechanical method by ultrasound probe (US) was applied. Gels were developed by Coomassie Brilliant Blue stain and scanned by GelDoc® XR+ BioRad®. The results showed that the addition of the charged surfactants [P4,4,4,14]Cl and CTAB and the non-ionic surfactant Triton X-114 were effective in recovering PspA4Pro, allowing its pre-purification. Thus, the cell permeabilization method employing surfactants can be a potentially effective process for the recovery of recombinant proteins.
Descrição
Palavras-chave
Pneumonia, Vacina, Extração, Purificação, Surfactantes
Idioma
Português
