Avaliação da diluição do DNA extraido de material parafinado para amplificação em PCR

Abstract

Introduction: Several reasons may lead to the failure of polymerase chain reaction (PCR) using DNA purified from paraffin-embedded materials: presence of inhibitors and degradation of target DNA. DNA dilution will often reduce the concentration of potential inhibitors and still contain enough DNA to allow PCR amplification. Objective: To evaluate the dilution influence of DNA purified from paraffin-embedded materials on β-globin PCR amplification. Material and Method: Paraffin-embedded blocks from 30 patients with oropharynx squamous cell carcinomas, diagnosed and treated at the Oral Oncology Center were selected. DNA extraction was performed using QIAmp minikit (Quiagen). DNA was quantified and evaluated for purity by spectrophotometer analysis. Two groups were formed with different amounts of DNA: group I had the originally extracted DNA and group II had the same DNA, however diluted with ultrapure water addition. PCR was performed in both groups using oligonucleotides for human β-globin gene. Results: For Group I, amplification of the β-globin gene sequence was successful in 33.33% of the samples and for Group II, in 23.33%. Conclusion: Dilution of the DNA extracted of paraffin-embedded materials did not modify statistically the amount of positive samples β-globin gene amplified in PCR, although the results suggest that this is a way to increase the method for efficacy amplification of PCR.

Introdução: Alguns fatores, como a presença de substâncias inibidoras e degradação do DNA, podem contribuir para a falha na detecção de genes, através da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir de DNA extraído de material parafinado. A diluição do DNA frequentemente pode reduzir o número de inibidores e contaminantes e ainda assim conter DNA suficiente para a amplificação em PCR. Objetivo: Avaliar a influência da diluição de soluções de DNA extraído de material parafinado na amplificação por PCR do gene β-globina humana. Material e método: Foram utilizados 30 blocos parafinados de carcinomas epidermoides de orofaringe referentes a pacientes diagnosticados e tratados no Centro de Oncologia Bucal da FOA-UNESP. A extração do DNA foi realizada com o sistema QIAamp DNA minikit (Quiagen). O DNA obtido foi quantificado e avaliado quanto à pureza por espectrofotometria. Dois grupos foram formados com diferentes quantidades de DNA, sendo que o Grupo I foi constituído pelo DNA originalmente extraído e o Grupo II com o mesmo DNA, porém diluído com adição de água ultrapura. Foi realizada a PCR utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para β-globina. Resultados: No Grupo I, 33,33% das amostras foram positivas para o gene β-globina, enquanto no Grupo II, 23,33% foram positivas. Conclusão: Neste estudo, a diluição do DNA extraído de material parafinado não alterou estatisticamente a quantidade de amostras positivas por PCR para o gene β-globina, embora os resultados obtidos sugiram que esta seja uma das formas de aumentar a eficácia do método de amplificação por PCR.