Impacto da estimulação sequencial durante a maturação in vitro de oócitos bovinos

Abstract

A maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos apresenta descompasso entre os processos fisiológicos e há grande interesse no desenvolvimento de abordagens para melhorar sua eficiência. Diante disso, o objetivo deste projeto foi de avaliar o impacto da estimulação sequencial da cascata ovulatória durante a MIV de oócitos bovinos e avaliar o efeito deste sistema sequencial associado a suplementação com NRG1 na etapa final do procedimento, a fim de aproximar o sistema de cultivo ao ambiente in vivo durante o cultivo. Assim, a MIV foi realizada com os seguintes tratamentos: FSH, SF (Sistema Folicular) e SF-s/A (Sistema Folicular sem adição de ampirregulina) durante 6 horas de cultivo e, em seguida, FSH, SF, S (MIV sequencial) e S+NRG1 (MIV sequencial + NGR1) durante 12 e 22 horas de cultivo. Ao final de cada tempo de MIV, os oócitos foram desnudos e corados com Hoechst para análise da progressão meiótica. Os dados foram transformados em arco-seno, testados por ANOVA e as diferenças foram consideradas significativas quando p ≤ 0,05. Em 6 horas de MIV, não houve diferenças entre os grupos SF-s/A e FSH, ambos apresentaram oócitos no estágio de vesícula germinativa, entretanto, o uso de AREG no SF promoveu um adiantamento da meiose, uma vez que houve aumento da quebra da vesícula germinativa. Motivo este que nos motivou a realizar um tratamento sequencial no meio SF durante a MIV. Assim, os grupos SF e S apresentaram maior número de oócitos em metáfase I às 12h, diferindo de FSH, enquanto S+NRG1 não apresentou diferenças dos demais grupos. Além disso, os oócitos atingiram a metáfase II às 22 horas e não houve diferença entre os tratamentos. Concluise que o presente estudo fornece evidências que a MIV de oócitos bovinos pode ser realizada de maneira sequencial, com o intuito de sincronizar a maturação nuclear com a citoplasmática para melhorar a eficiência dos protocolos de MIV

In vitro maturation (MIV) of bovine oocytes shows a mismatch in physiological processes and there is a big interest in the developing approaches to improve its efficiency. Therefore, this project’s objective was to evaluate the impact of ovulatory cascade sequential stimulation during MIV of bovine oocytes and to evaluate this sequential system effects associated to NRG1 supplementation in the procedure final step, in order to promote culture conditions more similar to the in vivo environment during the cell culture. This way, the MIV was performed with the following treatments: FSH, SF (follicular system) and SF- s/A (follicular system without addition of amphiregulin) during 6 hours of culture and, following, FSH, SF, S (sequential MIV) and S+NRG1 (sequential MIV + NRG1) for 12 and 22 hours of cell culture. At the end of each MIV time, the oocytes were denuded and stained with Hoechst to analyze the meiotic progression. The data were transformed into arcsine, tested by ANOVA and the differences were considered significant when P ≤ 0,05. At 6 hours of MIV, there were no differences between the groups SF-s and FSH, both showing oocytes in stage of germinal vesicle, however, when adding AREG in SF na advance in meiosis occurred, once there was na increasement in germinal vesicle breakdown. This reason motivated us to perform a sequential treatment in SF medium during the MIV. Thus, SF and S groups showed an increased number in oocytes in metaphase I at 12 hours, differing from FSH, while S+NRG1 did not showed differences to the other groups. Furthermore, oocytes reached metaphase II at 22 hours and did not showed differences between treatments. It is concluded that the present study provides evidence that bovine oocytes MIV can be performed in sequential manner, with the aim of synchronizing nuclear maturation with cytoplasmatic to improve the efficiency of MIV protocols.