Estudo da expressão gênica em aves de linhagens comerciais (Gallus gallus domesticus) experimentalmente infectadas por Salmonella Enteritidis: Padronização da técnica de RT-qPCR

Abstract

A técnica de qPCR, quantifica em tempo real baixas concentrações de ácidos nucleicos, por meio de fluorescência, presentes em amostras biológicas obtidas de diversas fontes. Trata-se de uma técnica padrão-ouro em pesquisas de expressão gênica e em diagnósticos laboratoriais. O presente trabalho tem como intuito padronizar a técnica de RT-qPCR, responsável pela quantificação da expressão gênica. Foram utilizadas duas estirpes (mutante e selvagem) de Salmonella Enteritidis em aves de um dia de vida que, posteriormente, foram eutanasiadas para a colheita de baço e tonsila cecal. Foi feita a extração de RNA dos tecidos, seguido de transcrição reversa para a execução das reações de RT-qPCR. A curva de normalização foi realizada para quatro genes de referência e, foi selecionado o gene 28S como o mais estável. Alguns detalhes como outros métodos de assepsia dos materiais para a extração de RNA e no momento do preparo das reações demonstraram pequenas diferenças e, consequentemente, contribuíram no êxito da padronização.

The qPCR technique quantifies extremely low amounts of nucleic acids in real-time, through fluorescence, present in biological samples obtained from different sources. It is considered a gold standard technique in gene expression research and laboratory diagnostics. The objective of the current work was to standardize the RT-qPCR technique, responsible for the quantification of gene expression. Two strains (mutant and wild) of Salmonella Enteritidis were used in one-day-old chicken, which was later euthanized for spleen and cecal tonsil collection. RNA extraction of tissues and reverse transcription were performed to the RT-qPCR reactions. A normalization curve was performed for four reference genes, and 28S gene was selected as the most stable. Some details, such as other methods of asepsis of the materials for RNA extraction and the time of preparation of the reactions, made minor differences that contributed to the success of the standardization.