Descoberta de anticorpos monoclonais humanos neutralizantes de serinoproteases a partir da técnica de Phage Display para produção de soro antibotrópico de nova geração

Envenomings by snakes of the genus Bothrops are frequently associated with hemostatic changes, inflammation, tissue damage, and coagulation disorders. Among the components of these venoms, serine proteases play an important role in hemostasis modulation, acting on fibrinogen, coagulation factors, platelets, and pathways related to clot formation. In this context, Moojase, a thrombin-like serine protease isolated from Bothrops moojeni venom, represents an important target for the study of procoagulant toxins and for the development of recombinant molecules with neutralizing potential. In this study, recombinant human antibody fragments of the scFv type against Moojase were selected and characterized, aiming to obtain molecules capable of recognizing this toxin and modulating functional activities associated with hemostasis. For this purpose, phage display technology was employed using the Griffin I library, with solution-phase biopanning against biotinylated Moojase and capture by streptavidin-conjugated magnetic beads. After successive selection rounds, biolayer interferometry screening, and individual clone evaluation, the scFvs ITX_MJ001-25 and ITX_MJ003-25 were prioritized, expressed in soluble format in Escherichia coli, purified, and evaluated for binding capacity, enzymatic modulation, interference with coagulation parameters, and cross-recognition against different venoms and toxins. Isolated Moojase showed a profile compatible with previously described serine proteases, with a single band close to 30 kDa, and structural modeling indicated conservation of the typical architecture of this enzymatic class. In functional assays, ITX_MJ001-25 and ITX_MJ003-25 modulated serine protease activity in chromogenic curves, suggesting interference with the catalytic dynamics of Moojase and related components in some crude venoms. In hemostatic assays, Moojase and B. moojeni crude venom showed a procoagulant effect, mainly on parameters associated with the intrinsic and/or common coagulation pathways, whereas the scFvs did not alter coagulation by themselves. ITX_MJ001-25 showed a greater effect in whole blood, while ITX_MJ003-25 showed a more evident response in plasma, especially in aPTT assays against Moojase. Cross-recognition analysis suggested possible interaction with components of bothropic venoms and, preliminarily, with Daboia russelii. Thus, this study produced, for the first time in the group, human scFvs against Moojase. The clones ITX_MJ001-25 and ITX_MJ003-25 showed target recognition capacity and potential to modulate functional activities associated with hemostasis, representing promising tools for the investigation of snake venom serine proteases and for the development of recombinant strategies aimed at the targeted neutralization of procoagulant toxins.

Resumo (português)

Os envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops estão frequentemente associados a alterações hemostáticas, inflamação, dano tecidual e distúrbios da coagulação. Entre os componentes dessas peçonhas, as serinoproteases (SVSPs) exercem papel relevante na modulação da hemostasia, sendo capazes de atuar sobre fibrinogênio, fatores da coagulação, plaquetas e vias relacionadas à formação do coágulo. Nesse contexto, a Moojase, uma SVSP semelhante à trombina isolada do veneno de Bothrops moojeni, representa um alvo importante para o estudo de toxinas pró-coagulantes e para o desenvolvimento de moléculas recombinantes com potencial neutralizante. Neste trabalho, foram selecionados e caracterizados fragmentos recombinantes de anticorpos humanos do tipo scFv contra a Moojase, com o objetivo de obter moléculas capazes de reconhecer essa toxina e modular atividades funcionais associadas à hemostasia. Para isso, foi empregada a tecnologia de phage display utilizando a biblioteca Griffin I, com biopanning em solução contra Moojase biotinilada e captura por esferas magnéticas conjugadas à estreptavidina. Após rodadas sucessivas de seleção, triagem por interferometria de biocamada e avaliação individual dos clones, os scFvs ITX_MJ001-25 e ITX_MJ003-25 foram priorizados, expressos em formato solúvel em Escherichia coli, purificados e avaliados quanto à capacidade de ligação, modulação enzimática, interferência em parâmetros de coagulação e reconhecimento cruzado frente a diferentes peçonhas e toxinas. A Moojase isolada apresentou perfil compatível com SVSPs já descritas, com banda única próxima de 30 kDa, e a modelagem estrutural indicou conservação da arquitetura típica dessa classe enzimática. Nos ensaios funcionais, ITX_MJ001-25 e ITX_MJ003-25 modularam a atividade de SVSP em curvas fluorogênicas, sugerindo interferência na dinâmica catalítica da Moojase e de componentes relacionados em algumas peçonhas. Nos ensaios hemostáticos, a Moojase e o veneno bruto de B. moojeni apresentaram efeito pró-coagulante, principalmente sobre parâmetros associados às vias intrínseca e/ou comum da coagulação, enquanto os scFvs não alteraram a coagulação por si só. ITX_MJ001-25 apresentou maior efeito em sangue total, enquanto ITX_MJ003-25 demonstrou resposta mais evidente em plasma, especialmente em ensaios de aPTT frente à Moojase. A análise de reconhecimento cruzado sugeriu possível interação com componentes de peçonhas botrópicos e, preliminarmente, com Daboia russelii. Assim, este estudo produziu, de forma pioneira no grupo, scFvs humanos contra a Moojase. Os clones ITX_MJ001-25 e ITX_MJ003-25 demonstraram capacidade de reconhecimento do alvo e potencial de modulação de atividades funcionais associadas à hemostasia, representando ferramentas promissoras para a investigação de SVSPs de peçonhas de serpentes e para o desenvolvimento de estratégias recombinantes voltadas à neutralização direcionada de toxinas pró-coagulantes.

Palavras-chave

Anticorpos monoclonais , Antivenenos , Bacteriófagos , Doenças Tratamento

Idioma

Português

Citação

ROMANAZZI, Marcela. Descoberta de anticorpos monoclonais humanos neutralizantes de serinoproteases a partir da técnica de Phage Display para produção de soro antibotrópico de nova geração. 2026. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2026.