Análise e desenvolvimento de processos de separação de biomoléculas utilizando Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)
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Data
2021-12-16
Autores
Oshiro, Ariane Alves
Título da Revista
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
A Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) une o princípio de extração líquido-líquido à eficácia das técnicas cromatográficas, promovendo inúmeras etapas sequenciais de partição do soluto, e podendo, assim, aumentar a eficiência da extração. Devido à existência de uma fase estacionária líquida, esta técnica destaca-se por sua elevada capacidade preparativa e versatilidade na separação de compostos em uma vasta gama de polaridades. Apesar de suas vantagens, ainda existem uma série de obstáculos a serem superados para que a CPC seja amplamente empregada na recuperação de biomoléculas, tais como: i) conservação da estabilidade do equilíbrio hidrodinâmico entre as fases líquidas imiscíveis (representado pela retenção de fase estacionária (SF)); ii) aumento da pressão de retorno do sistema decorrente do escoamento das fases na coluna. Isto posto, este trabalho consistiu em compreender as condições hidrodinâmica de sistemas líquidos bifásicos aplicados em CPC capazes de promover a operação adequada do equipamento e realizar a partição e separação seletiva de biomoléculas. Para tanto, foi realizado, primeiramente, um estudo hidrodinâmico dos efeitos sob a pressão de retorno e na SF devido à variação de três parâmetros operacionais: velocidade de rotação da coluna; fluxo de fase móvel; modo de operação (ascendente ou descendente). Numa segunda fase, foram realizados estudos de casos para avaliar a capacidade de partição e separação de biomoléculas em CPC, utilizando sistemas aquosos bifásicos (SAB) para partição de L-tirosina, riboflavina, ácido gálico e ácido vanílico, e sistema líquido-líquido tradicional (i.e., aquosoorgânico) para partição dos carotenoides β-caroteno e astaxantina. Os resultados obtidos permitiram compreender o comportamento dos fenômenos hidrodinâmicos em função das variáveis operacionais. Nesse sentido, foram identificados dois efeitos hidrodinâmicos principais, a saber, uma forte influência da velocidade de rotação da coluna e viscosidade das fases do sistema no aumento da pressão de retorno, e um efeito negativo na SF devido ao aumento do fluxo de fase móvel. A compreensão da hidrodinâmica do CPC permitiu definir limites aos parâmetros operacionais adequados à operabilidade do equipamento para o SAB composto por K2HPO4 e etanol. Embora do ponto de vista processual o SAB composto por K2HPO4 e etanol seja promissor para a separação de compostos hidrofílicos, a separação das biomoléculas modelo foi inviabilizada, provavelmente devido à degradação destas no pH altamente alcalino (pH ≈ 10) das fases do sistema. Por outro lado, a aplicação do sistema bifásico aquoso-orgânico (Hexano + Acetona + Etanol +H2O) possibilitou a separação dos carotenoides β-caroteno e astaxantina, apresentando um potencial para a extração seletiva destes pigmentos a partir de matrizes complexas (p.ex. meios de cultivo).
Centrifugal partition chromatography (CPC) combines the principle of liquid-liquid extraction with the efficacy of chromatographic techniques, allowing numerous sequential solute partition steps, and thus increasing the extraction efficiency. Due to the existence of a liquid stationary phase, CPC stands out for its high preparative capacity and versatility in the separation of compounds in the entire polarity scale. Despite its advantages, some drawbacks must be overcome for CPC to be widely used in the recovery of biomolecules, namely: i) the maintenance of the hydrodynamic equilibrium between immiscible liquid phases (represented by the retention of the stationary phase (SF); ii) the increase of backpressure of CPC due to phase flow in the column. Therefore, this work comprised in understanding the hydrodynamic conditions of two-phase liquid systems applied in CPC capable of promoting the proper operation of the equipment and perform the partition and selective separation of biomolecules. For this purpose, firstly, a hydrodynamic study to evaluate the backpressure and SF due to the variation of three operational parameters, i.e., column rotation speed, mobile phase flow, and mode of operation (ascendant or descendant) was carried out. In a second stage, specific case studies were carried out to determine the partition/separation of biomolecules in CPC, namely, using aqueous biphasic systems (ABS) for the partition of L-tyrosine, riboflavin, gallic acid, and vanillic acid, and traditional liquid-liquid system (i.e., aqueous-organic) for the partition of β-carotene and astaxanthin carotenoids. The results allowed us to understand the behavior of hydrodynamic phenomena as a function of operational variables. In this regard, two major hydrodynamic effects were identified, namely, a strong influence of column rotation speed and the viscosities of the phases on increasing the backpressure of the CPC system, and a negative effect on SF due to increasing of mobile phase flow. The understanding of CPC hydrodynamics allowed to define adequate operational parameters limits for CPC using the ABS composed of K2HPO4 and ethanol. Although from a processual perspective this ABS is promising for the separation of hydrophilic compounds, their separation was not successful, probably due to degradation at the high alkaline pH conditions of these ABS (pH ≈ 10). On the other hand, the application of an aqueous-organic biphasic system (Hexane + Acetone + Ethanol + H2O) enabled the separation of β-carotene and astaxanthin carotenoids, confirming the potential of CPC for selective extraction of these pigments from complex matrix (e.g., culture medium).
Centrifugal partition chromatography (CPC) combines the principle of liquid-liquid extraction with the efficacy of chromatographic techniques, allowing numerous sequential solute partition steps, and thus increasing the extraction efficiency. Due to the existence of a liquid stationary phase, CPC stands out for its high preparative capacity and versatility in the separation of compounds in the entire polarity scale. Despite its advantages, some drawbacks must be overcome for CPC to be widely used in the recovery of biomolecules, namely: i) the maintenance of the hydrodynamic equilibrium between immiscible liquid phases (represented by the retention of the stationary phase (SF); ii) the increase of backpressure of CPC due to phase flow in the column. Therefore, this work comprised in understanding the hydrodynamic conditions of two-phase liquid systems applied in CPC capable of promoting the proper operation of the equipment and perform the partition and selective separation of biomolecules. For this purpose, firstly, a hydrodynamic study to evaluate the backpressure and SF due to the variation of three operational parameters, i.e., column rotation speed, mobile phase flow, and mode of operation (ascendant or descendant) was carried out. In a second stage, specific case studies were carried out to determine the partition/separation of biomolecules in CPC, namely, using aqueous biphasic systems (ABS) for the partition of L-tyrosine, riboflavin, gallic acid, and vanillic acid, and traditional liquid-liquid system (i.e., aqueous-organic) for the partition of β-carotene and astaxanthin carotenoids. The results allowed us to understand the behavior of hydrodynamic phenomena as a function of operational variables. In this regard, two major hydrodynamic effects were identified, namely, a strong influence of column rotation speed and the viscosities of the phases on increasing the backpressure of the CPC system, and a negative effect on SF due to increasing of mobile phase flow. The understanding of CPC hydrodynamics allowed to define adequate operational parameters limits for CPC using the ABS composed of K2HPO4 and ethanol. Although from a processual perspective this ABS is promising for the separation of hydrophilic compounds, their separation was not successful, probably due to degradation at the high alkaline pH conditions of these ABS (pH ≈ 10). On the other hand, the application of an aqueous-organic biphasic system (Hexane + Acetone + Ethanol + H2O) enabled the separation of β-carotene and astaxanthin carotenoids, confirming the potential of CPC for selective extraction of these pigments from complex matrix (e.g., culture medium).
Descrição
Palavras-chave
Extração líquido-líquido, Sistemas Aquosos Bifásicos, Cromatografia de Partição Centrífuga, Hidrodinâmica, Separação, Biomoléculas